현대인의 건강 지향적 소비패턴에 따라 식품 분야에서도 생리활성 성분을 탑재하거나 특정 물성을 부여하는 식품소재의 수요가 증가하고 있다(Granato 등, 2017; Putnik 등, 2018). 이러한 소비자의 니즈를 충족시키는 식품 원재료로는 곡류, 채소류, 과일류, 견과류, 해조류 등 식물성 식품군이 대표적이며, 이들 식품에 함유된 피토케미컬(phytochemicals)의 항산화, 항암, 항염 등의 생리활성과 식이섬유를 포함한 다당류의 물리적 기능성은 타깃 식품의 품질을 향상시키는 데 활용되고 있다(Putnik 등, 2018). 이와 관련하여 최근에는 기존의 식품 원재료에 내용물 전달 기술(delivery systems), 열처리 기술, 생물학적 처리기술 등 식품가공기술을 적용하여 새로운 기능성을 부가하는 식품 신소재 개발산업이 성장하고 있다(Sun 등, 2022; Yang 등, 2020). 이 중 오랜 역사를 지닌 발효는 미생물을 활용하는 생물학적 처리기술로, 발효 조건을 조절하여 식품 원재료의 화학적 조성을 변화시킴으로써 원하는 특성을 얻을 수 있어 잠재력이 큰 식품가공기술로 인지되고 있다(Sun 등, 2022). 본 연구에서는 식품 원재료에 기능성을 부가해 차별화된 식품 신소재를 개발하기 위해 전구체인 식품 원재료로는 곡물을, 식품가공기술로는 발효 공정을 활용하고자 하였다.

곡물은 일상의 식단을 구성하는 주요한 식품 원재료로, 각 지역의 식문화에 따라 밥, 떡, 빵, 시리얼과 그래놀라, 파스타, 면 등 다양한 형태로 조리 및 가공되어 소비되고 있다. 곡물은 식이섬유 함량이 높고 단백질, 비타민, 무기질 등 필수영양소를 제공하고 있으나, 탄수화물로 편중된 주요 에너지 공급원이다(Wheeler와 Pi-Sunyer, 2008). 따라서 건강지향과 간편성을 추구하는 소비자의 니즈를 충족하기 위해서는 곡물 및 곡물 가공품에서도 이화학적 기능성을 개선하기 위한 시도가 필요하다. 본 연구에서는 곡물의 주요 구성 성분이 탄수화물이라는 점을 고려하여 탄수화물 대사로 차별화된 기능 성분 및 향미 성분 프로파일을 제공하는 유산균을 발효 공정의 미생물로 선정하였다.

유산균 발효 공정(lactic acid fermentation)은 미생물이 탄수화물을 대사하여 젖산으로 전환하고 생리활성을 보유한 다양한 대사체를 생성하는 능력을 식품에 활용한 바이오 공정이다. Streptococcus 속, Leuconostoc 속, Lactobacillus 속의 유산균과 Bifidobacterium 속 비피더스균이 젖산발효 과정에 주도적으로 관여하여 최종 생성물의 화학적 조성과 나아가 관능적 품질특성을 변화시키는 데 기여한다. 특히 젖산은 식품의 pH를 낮추어 유해균의 증식을 억제함으로써 저장성을 높이고, 미생물 고유의 효소작용으로 생성된 저분자 물질은 식품에 새로운 향미와 물성을 부여할 수 있다(Admassie, 2018; Sun 등, 2022).

본 연구에서는 식품 매트릭스에 유익한 변화를 부여하는 유산균 발효의 잠재력을 “혼합곡물(Grain mixture, GM)”에 적용하여 “발효 혼합곡물(Fermented GM)”을 제조하고 이화학적 특성을 분석함으로써 식품 신소재로서 원재료와는 차별화된 가치를 확인하고자 하였다. 구체적으로는 식물유래 식품군에서 빈번히 관찰되는 제한아미노산에 의한 단백질의 질적 한계를 개선하기 위해 단일곡물이 아닌 혼합곡물을 사용하였다. 특히, 곡류 및 두류 중 단백질 함량이 비교적 높고 아미노산 조성이 상호 보완되도록 콩, 보리, 현미, 밀을 혼합곡물의 원재료들로 구성하였다. 또한 개별 미생물이 지닌 다양한 효소 활성의 이점을 종합적으로 활용하고자 유산균 3종과 비피더스균 1종을 포함한 총 4종의 미생물을 함께 처리하였다. 이를 통해 곡물기반 식품 신소재를 다양화하는 데 발효 공정의 활용 가능성을 실제 실험 사례로 제시하고자 하였다.

실험재료 및 시약

본 연구에서 사용한 곡물은 국내산 콩, 보리쌀, 현미, 밀로 강원도 삼척에서 구매하였다. 복합유산균(mixed lactic acid bacteria)과 비피더스균(bifidobacteria)은 셀바이텍에서 구매하여 사용하였다. 복합유산균은 Streptococcus lactis (1.0×10⁹ CFU/g), Streptococcus thermophilus(1.0×10⁹ CFU/g), Lactobacillus acidophilus(1.0×10⁹ CFU/g)가 혼합된 동결건조 생균제였으며, 비피더스균은 Bifidobacterium longum KCTC 5734(1.0×10¹⁰ CFU/g)로 동결건조된 상태로 사용하였다.

분석 시약으로 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, 갈산(gallic acid monohydrate), 1,1,3,3-tetraethoxypropane, ninhydrin은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 디에틸에테르, 황산, 붕산, sodium hydroxide는 Showa Chemical Industry Co.의 특급시약을 사용하였다. Protease, α-amylase, amyloglucosidase는 Megazyme International Ireland Ltd.에서 구매하였다. 2-Thiobarbituric acid(TBA, 4,6-dihydroxy-2-mercaptopyrinidine 98%)는 Tokyo Chemical Industry에서, ascorbic acid는 Junsei Chemical Co.에서, trichloroacetic acid(TCA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.에서 각각 구입하였다. 시약 제조에는 탈염･탈이온수를 사용하였다.

발효 혼합곡물 제조

혼합곡물은 콩, 보리쌀, 현미, 밀을 4:2:2:2의 중량 비율로 혼합한 후 지역소재 방앗간에서 곡물분쇄기로 분말화하여 사용하였다(Fig. 1A). 혼합곡물 분말(2 kg)과 증류수(5 L)를 혼합하고 여기에 3종의 복합유산균 200 g과 B. longum KCTC 5734균 100 g을 첨가하여 37°C에서 호기적으로 5일 동안 배양(shaking incubator, SI-4000R, Jeio Tech)하였다. 혼합곡물 분말과 증류수 혼합비율은 1:1부터 1:3까지 증가시키면서 유산균 첨가 후 교반의 용이성을 고려하여 결정하였다. 이후 배양액을 -80°C에서 24시간 동안 동결건조(FDU-1200, Eyela)하여 발효 혼합곡물로 사용하였다(Fig. 1B).

Fig 1. Preparation of the grain mixture (GM, A) and the GM fermented by lactic acid bacteria (fermented GM, B). Fermented GM was produced by fermenting GM using a mixture of Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, and Bifidobacterium longum KCTC 5734.

일반성분 및 식이섬유 분석

일반성분은 AOAC 방법(Method 945.38)을 따랐다(AOAC, 1990). 수분은 105°C 건조기(OF-12, Jeio Tech)를 이용한 상압가열건조법, 조회분은 550°C 회화로(MF31G, Jeio Tech)에서 직접회화법으로 분석하였다. 조단백질은 킬달 분해장치(Digestion unit K-424, Buchi), 증류장치(Kjelflex K-360, Buchi), 적정장치(702 SMTitrino Metrohm, Buchi)를 연속으로 사용하여 micro-Kjeldahl법으로 분석하였으며 질소계수 6.25를 사용하여 함량을 산출하였다. 조지방은 디에틸에테르를 용매로 하여 Soxhlet 장치(E-816, Buchi)로 추출하였다. 탄수화물은 차감법[100－(수분+조회분+조단백질+조지방)]으로 산출하였다.

식이섬유는 AOAC 방법(Method 985.29)에 따라(AOAC, 1990) 효소중량법(enzymatic-gravimetric method)으로 분석하였다. 시료에 효소(amylase, protease, amyloglucosidase)를 처리한 분해단계, 에탄올을 가하여 식이섬유를 침전시킨 단계, 여과단계(Fibertec System E 1023 Filtration Module, Foss)를 순차적으로 거쳤다. 이후 반응물을 105°C 상압가열건조법으로 건조하고 회분과 단백질을 각각 직접회화법과 micro-Kjeldahl법으로 정량하였다. 반응물의 건조중량에서 회분과 단백질 함량을 차감하여 식이섬유 함량을 산출하였다.

가용성 고형분, 적정산도, pH, 총환원력 및 색도 분석

시료 1 g에 증류수 19 mL를 첨가하여 homogenizer(Wise Mix HG-15, Daihan Scientific)로 1분간 교반하였다. 3,061 ×g에서 20분간 원심분리(5810R, Eppendorf)하여 얻은 상층액을 분석에 사용하였다. 가용성 고형분(soluble solids)은 상층액의 굴절률(N-1α, Atago)을 측정하여 당 농도(Degrees Brix, °Bx)로 나타내었으며, pH는 pH meter (725P, Istek)로 측정하였다. 증류수에 의한 희석배수는 측정된 값에 반영하지 않았다. 적정산도(titratable acidity)는 0.01 N NaOH로 중화 적정하여 유산균 발효 중 주로 생성되는 젖산(lactic acid, 60.05 g/mol) 당량으로 산출하였다.

총환원력은 Folin-Ciocalteu reagent법(Singleton 등, 1999)으로 분석하였으며, 실험에 사용한 물 추출물은 다음의 과정으로 준비하였다. 분말 1 g에 증류수(19 mL)를 첨가하여 25°C shaking water bath(BS-21, Jeio Tech)에서 왕복운동(reciprocating motion) 모드로 교반하면서 30분간 추출하였다. 이후 3,061×g에서 20분간 원심분리(5810R)하여 얻은 상층액을 물 추출물로 사용하였다. 물 추출물 200 μL에 증류수 800 μL를 넣고, Folin-Ciocalteu’s reagent와 Na₂CO₃를 각각 1 mL씩 넣어 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응물의 흡광도를 spectrophotometer(UV-1650, Shimadzu)로 700 nm에서 측정하였다. 총환원력은 갈산 당량(gallic acid equivalent, GAE)으로 나타내었다.

색도는 색차계(CR400, Konica Minolta Sensing)를 사용하여 명도(lightness, L), 적색도(redness, a), 황색도(yellowness, b)를 측정하였다. 표준 백색판을 이용하여 calibration 한 후, L값은 0(검은색)에서 100(흰색)까지, a값은 -80(녹색)에서 100(적색)까지, b값은 -70(청색)에서 70(황색)까지의 범위에서 색도를 측정하였다. 표준 백색판의 값은 L=97.10, a=-0.02, b=1.82였다.

아미노산 조성 분석

아미노산 분석을 위한 전처리는 Hitachi에서 공급한 매뉴얼에 수록된 방법을 일부 변형하여 수행하였다. 구성아미노산 분석을 위해 시료 약 400~500 mg에 6 N HCl을 약 10 mL 첨가하여 110°C에서 22시간 동안 가수분해하였다. 이후 진공 농축과 건조과정을 통해 HCl을 제거하고 증류수로 100 mL까지 정용한 후 0.45 μm syringe filter(AD. 13CP 045AS, Advantec)로 여과시켜 아미노산 분석기(Hitach L-8800 amino acid, Hitachi)에 주입하였다. 유리아미노산 분석을 위해서는 50 mL 원심분리관에 시료 약 5 g과 70% 에탄올 30 mL를 넣어 1시간 동안 교반한 후 10분 동안 방치하였다. 10,500×g에서 15분 동안 원심분리(CP 100MX, Hitachi)한 후 상층액을 농축 플라스크로 옮기고, 남은 침전물에 70% 에탄올 25 mL를 넣어 교반과 원심분리를 2회 추가 반복하고 상층액을 취하여 농축 플라스크에 합하였다. 진공 농축한 후 증류수로 150 mL까지 정용하고 0.45 μm syringe filter(AD. 13CP045AS)로 여과하여 아미노산 분석기에 주입하였다. 이온교환수지 컬럼(Ion exchange column, lithium form, 4.6 mm×60 mm, Hitachi)에 다양한 pH와 이온강도를 가진 buffer를 흘려 아미노산을 분리하였다. 반응코일에서 아미노산이 ninhydrin과 반응하여 형성한 발색 화합물의 흡광도를 570 nm와 440 nm에서 측정하였다. 컬럼이 장착된 오븐 온도는 30~70°C, 반응코일 온도는 135°C, 유속은 0.35 mL/min, 시료 주입액은 20 μL였다. 아미노산 함량은 표준용액 1점을 주입하여 얻어진 크로마토그램으로부터 농도와 면적의 비례식으로 계산되었다.

입도분포, 물 결합력, 점도 및 분산성 분석

Testing sieve 45(aperture 355 μm, wire diameter 224 μm, Chunggye)에 분말을 통과시킨 후 증류수에 분산시킨 상태로 입도분석기(particle size analyzer, Analysette22 Nano Tech, Fritsch)를 사용하여 0.10~300.03 μm 범위의 입자에 대해 입도분포(particle size distribution)를 측정하였다. 입자 크기는 동일한 표면적의 구를 기준으로 산출된 “표면적 평균직경(surface weighted mean diameter, d₃₂=∑n_id_i³/∑n_id_i²)”, 동일한 부피의 구를 기준으로 산출된 “부피 평균직경(volume-weighted mean diameter, d₄₃=∑n_id_i⁴/∑n_id_i³)”, 비표면적(specific surface area per volume, cm²/cm³)으로 나타내었다. 물 결합력은 Medcalf와 Gilles (1965)의 방법을 따랐다. 분말 1 g에 냉수(4°C) 또는 온수(82°C) 40 mL를 첨가하여 간헐적으로 30분간 교반하였다. 3,061×g에서 20분 동안 원심분리한 후(5810R), 상층액을 제거한 침전물의 무게를 측정하였다. 원 시료 무게에 대한 침전물의 증가한 무게 %를 물 결합력으로 계산하였다.

점도 측정을 위해 혼합곡물에 증류수를 첨가하여 발효 혼합곡물의 동결건조 전 슬러지 상태와 농도를 동일하게 맞추었다. Viscometer(LVDV-II+Pro, Brookfield Engineering Laboratories)에 spindle(No.64)을 장착하고 22.7±0.5°C에서 시료를 교반하면서 점도를 측정하였다. 분산성 확인을 위해 분말 0.5 g에 증류수(9.5 mL)를 넣고 충분히 교반한 후 실온에서 정치하였다. 침강지수(sedimentation index)는 용액 높이(H₂)에 대한 침전물 높이(H₁)의 백분율로 나타내었다(100×H₁/H₂).

산화안정성 평가

Kornbrust와 Mavis(1980)의 방법을 변형하여 분말의 산화안정성을 평가하였다. 분말을 철과 ascorbic acid를 포함한 산화유도 시스템에 노출한 후, 시간 경과에 따른 malondialdehyde(MDA) 생성량을 측정하였다. 분말(2 g)에 1.15% KCl 21 mL를 첨가하여 homogenizer(Wise Mix HG-15)로 1분 동안 균질화하였다. 여기서 2.5 mL를 취하여 80 mM tris-malate buffer(pH 7.4) 12.5 mL, 5 mM FeSO₄･7H₂O 5 mL, 2 mM ascorbic acid 5 mL를 차례대로 넣고 10초 동안 교반한 후 37°C 항온수조(BS-21)에 넣었다. 반응액을 항온수조에 넣은 시점(0분)부터 반응 진행 후 20, 40, 60, 90, 150, 210, 270, 330분에 반응액 중 2 mL를 취해 TBA-TCA-HCl이 혼합된 반응 시약(15% TCA+ 0.37% TBA in 0.25 N HCl) 4 mL를 넣고 교반한 후, 100°C에서 정확히 15분 동안 반응시켰다. 차가운 물로 식혀 반응을 종결시키고 1,811×g에서 15분 동안 원심분리(5810R)하였다. 상층액을 spectrophotometer(UV-1650)로 531 nm에서 흡광도를 측정함으로써 반응액 속에 형성된 MDA- TBA complex를 정량하였다. MDA 전구체인 1,1,3,3-tetraethoxypropane을 사용하여 표준정량곡선을 작성하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 반복하였으며 평균±표준편차로 나타내었다. 혼합곡물과 발효 혼합곡물의 이화학적 특성 비교는 t-test(Microsoft Office Excel)로 차이의 유의성을 확인하였다.

유산균 발효가 혼합곡물의 화학적 조성과 색도에 미친 영향

콩, 보리, 현미, 밀로 구성된 혼합곡물의 일반성분을 분석한 결과(Table 1), 단백질 함량은 22.8%로 탄수화물(65.6 %) 다음으로 높았으며 식이섬유가 11.3%를 차지하였다. 이 혼합곡물에 유산균을 접종하여 37°C에서 5일 동안 발효하여 제조한 발효 혼합곡물은 수분함량이 6.5%로 발효 전(1.9 %)보다 유의적으로(P<0.001) 높았으나, 탄수화물과 단백질은 발효 전과 유의적으로 다르지 않았다. 반면 식이섬유 함량은 11.3%에서 발효 후 5.3%로 유의적으로(P<0.05) 감소하였으며, 수분에 의한 희석효과를 고려해도 6.4%로 계산되어 발효에 의해 유의적으로 감소했음을 알 수 있었다. 이는 발효식품에서 관찰되는 전형적인 현상으로, 미생물의 효소적 분해작용으로 혼합곡물 속 고분자의 식이섬유가 저분자화된 결과이다. 발효 후 식이섬유의 유의적 감소에도 불구하고 탄수화물 총량이 일정하게 유지된 결과는 분석법에서 기인하였다. 즉 식이섬유는 효소중량법으로 직접 정량되었지만, 탄수화물은 차감법으로 산출되어 식이섬유 및 이들이 분해된 당 모두를 포괄한 값이므로 식이섬유만의 변화를 반영할 수 없었기 때문이다. 한편, 유산균이 지닌 탄수화물 분해효소 및 단백질 분해효소의 작용으로(Kim 등, 2016), 가용성 고형분 함량은 0.9°Bx에서 2.0°Bx로 유의적으로(P< 0.001) 증가하였다. 젖산 당량으로 나타낸 적정산도의 경우, 발효 혼합곡물은 4,779 mg%로 발효 전 1,309 mg%보다 유의적으로(P<0.001) 높았다. 이는 유산균이 보유한 효소작용으로 고분자 탄수화물이 가수분해되어 포도당이 생성되고 이로부터 젖산 등 유기산이 생성된 결과이다. 실험에 사용된 Streptococcus 속 S. lactis, S. thermophilus, Lactobacillus 속 L. acidophilus는 포도당 등의 6탄당을 기질로 젖산을 생성하는 대표적 정상 발효(homofermentative) 젖산균이다. 또한 Bifidobacterium 속 B. longum은 포도당을 탄소원으로 하여 bifidus pathway를 거쳐 젖산과 초산을 2:3의 비율로 생성하는 것으로 알려져 있다(Axelsson, 1998). 이들 젖산균이 생성한 유기산으로 발효 혼합곡물의 pH는 6.27에서 3.60으로 유의적으로(P<0.001) 감소하였다.

Table 1 . Changes in the chemical compositions and color of grain mixture (GM) by lactic acid bacteria fermentation.

Composition		GM	Fermented GM	Significance2)
Moisture (%)		1.9±0.61)	6.5±0.1	***
Protein (%)		22.8±1.2 (23.2±1.1)	22.0±0.1 (23.5±0.1)	NS (NS)
Ash (%)		2.7±0.1 (2.8±0.0)	2.4±0.1 (2.6±0.1)	** (*)
Fat (%)		6.8±1.2 (7.1±0.9)	5.6±0.1 (6.0±0.0)	NS (NS)
Carbohydrates (%)		65.6±1.5 (66.9±1.8)	63.5±0.2 (67.9±0.2)	NS (NS)
Dietary fiber (%)		11.3±1.1 (11.9±1.1)	5.3±3.5 (6.4±3.0)	* (*)
Soluble solids (°Bx)		0.9±0.0	2.0±0.0	***
Titratable acidity (mg% as lactic acid)		1,309±94	4,779±89	***
pH		6.27±0.01	3.60±0.04	***
Total reducing capacity (μg/g GAE)		225±240	2,371±111	***
Color	L	75.52±0.64	61.02±5.14	**
	a	3.53±0.18	6.61±0.52	***
	b	24.82±0.32	26.23±1.69	NS

¹⁾The value was expressed as the mean±standard deviation of triplicate experiments. The value in parentheses represents the concentration calculated on a dry basis..

²⁾*, **, and *** mean that the values within the same row are significantly different at P<0.05, P<0.01, and P<0.001, respectively. NS means ‘not significant’..

페놀성 및 비페놀성 환원물질을 정량한 총환원력은 갈산 당량으로 혼합곡물이 225 μg/g, 발효 혼합곡물이 2,371 μg/ g으로, 발효 이후 10.5배까지 유의적으로(P<0.001) 증가하였다(Table 1). 이는 탄수화물 분해효소의 작용으로 환원당이 증가하고, β-글루코시다아제(β-glucosidase)에 의해 배당체 형태의 폴리페놀이 가수분해되어 비배당체로 전환된 결과로 해석된다. 실제로 유산균 발효에 의해 콩 속 배당체에서 비배당체가 생산된 결과들이 보고된 바 있으며(Donkor와 Shah, 2008; Kim 등, 2010), 본 실험에서 사용된 B. longum KCTC 5734는 다양한 비피더스균 중에서도 배당체 이소플라본을 비배당체로 전환시키는 전환율이 매우 높은 것으로 보고되었다(Kim 등, 2014a). 비배당체는 배당체보다 장내흡수율이 높을 뿐 아니라 동일한 몰 농도를 기준으로 했을 때 항산화 활성도 높은 것으로 알려져 있다. 일례로, Kim 등(2014b)은 페놀성 플라보노이드인 캠페롤과 그 배당체들의 항산화 활성을 비교한 연구에서, 분자구조가 동일한 물질이라도 배당체에서 당이 제거됨에 따라 DPPH 라디칼 소거 활성 등 항산화 활성이 증가한 현상을 확인하였다.

한편, 혼합곡물은 발효 후 색 특성에서 유의적 변화가 관찰되었다(Table 1, Fig. 1). 명도가 75.52에서 61.02로 유의적으로(P<0.01) 감소하였고, 적색도는 3.53에서 6.61로 유의적으로(P<0.001) 증가하였다. 이는 발효 중 미생물에 의한 효소작용으로 혼합곡물 속 탄수화물과 단백질이 가수분해되어 저분자화되면서 카르보닐기와 아미노기를 보유한 분자들의 입체장애가 감소해 Maillard 갈변반응의 반응속도가 빨라진 결과로 해석하였다(BeMiller와 Huber, 2007). 실제로 아미노산 분석 결과(Table 2), 유리아미노산 함량의 경우 혼합곡물은 276 mg%로 총 아미노산 함량의 1.3%를 차지했지만, 발효 혼합곡물은 619 mg%로 전체 아미노산의 3.2%를 차지함으로써 유산균 발효 중 곡물 속 단백질이 가수분해되었음을 시사하였다. 발효 여부와 관계없이 두 곡물의 주요한 아미노산은 글루탐산(glutamic acid)> 프롤린(proline)> 아스파르트산(aspartic acid)> 아르기닌(arginine)≈루신(leucine) 순으로 확인되었다. 아미노산 분석 결과에서 주목할 만한 특징으로는 첫째, 발효로 γ-amino-n- butyric acid(GABA) 함량이 8 mg%에서 77 mg%로 증가하였고 이와 함께 글루탐산 함량은 감소하였다. 신경전달물질의 일종인 GABA는 혈압강하 기능성을 지닌 아미노산으로, 글루탐산 탈탄산효소(glutamate decarboxylase, GAD)의 작용으로 글루탐산에서 카르복실기가 제거되어 생성된다(Yogeswara 등, 2020). 둘째, 혼합곡물에서는 검출되지 않았던 오르니틴(ornithine)과 시트룰린(citrulline)이 발효 후 각각 109 mg%와 27 mg% 농도로 확인되었고, 이와 함께 유리형태의 아르기닌이 123 mg%에서 2 mg%로 감소하였다. 아르기닌은 아르기닌 디이미나아제(arginine deiminase, ADI)의 작용에 의해 항비만인자인 오르니틴을 생성하고 그 과정에서 중간산물로 시트룰린을 생성한다(Inoue 등, 2022). 발효 혼합곡물에서 관찰된 이러한 변화는 본 실험에서 사용한 S. thermophilus와 S. lactis가 지닌 GAD 활성(Hagi 등, 2016; Kim과 Choi, 2022)과 S. lactis가 지닌 ADI 활성(Crow와 Thomas, 1982; Inoue 등, 2022)에서 기인한 것으로 해석된다.

Table 2 . Changes in the amino acids composition of grain mixture (GM) by lactic acid bacteria fermentation (mg%).

Amino acids	GM1)			Fermented GM1)
	Free	Bound	Total	Free	Bound	Total
Phosphoserine	ND2)	ND		10	ND	10
Taurine	ND	ND		13	ND	13
Aspartic acid	2300%	1,945	1,968	20	1,752	1,772
Threonine	200%	780	782	14	722	736
Tryptophan	ND	ND		ND	ND
Serine	700%	1,130	1,137	10	1,000	1,010
Glutamic acid	1900%	3,981	4,000	22	3,585	3,607
α-Amino adipic acid	200%	ND	2	5	ND	5
Glycine	700%	787	794	20	712	732
Alanine	3200%	965	997	37	882	919
α-Amino-n-butyric acid	ND	ND		ND	ND
Citrulline	ND	ND		27	ND	27
Valine	3	707	710	30	646	676
Cystine	ND	346	346	ND	336	336
Methionine	2	214	216	8	207	215
Cystathionine	ND	ND		4	ND	4
Isoleucine	2	558	560	18	496	514
Leucine	2	1,405	1,407	42	1,237	1,279
Tyrosine	6	451	457	14	427	441
Phenylalanine	9	977	986	26	850	876
β-Alanine	10	ND	10	15	ND	15
β-Amino isobutyric acid	ND	ND		9	ND	9
γ-Amino-n-butyric acid	8	ND	8	77	ND	77
Ethanolamine	2	ND	2	7	ND	7
Ammonia	7	468	475	31	469	500
Hydroxylysine	ND	ND		ND	ND
Ornithine	ND	ND		109	ND	109
Lysine	3	772	775	11	694	705
Histidine	5	468	473	9	415	424
Carnosine	ND	ND		ND	ND
Arginine	123	1,323	1,446	2	1,012	1,014
Proline	ND	3,932	3,932	29	3,501	3,530
Total	276	21,209	21,485	619	18,943	19,562

¹⁾Values are the average of duplicate experiments..

²⁾ND means ‘not detected’..

유산균 발효가 혼합곡물의 입자특성과 물 결합력에 미친 영향

혼합곡물과 발효 혼합곡물의 입도분포를 측정한 결과는 Fig. 2A와 같다. 두 곡물은 100 μm 이하의 입자들이 차지하는 부피비율(volume fraction)이 서로 다르지 않았다. 그러나 100~200 μm 입자크기 영역에서 혼합곡물은 bimodal 형태의 입도분포를 보였던 반면, 발효 혼합곡물은 이보다 입자크기가 작은 영역으로 그래프가 shift 된 현상이 관찰되었다. 입도분포도의 10%, 50%, 90% 지점에서의 입자크기를 비교했을 때, 발효 혼합곡물은 각각 8.382, 33.821, 104.690 μm로 혼합곡물(9.897, 55.157, 160.812 μm)보다 작았다(Table 3). 또한 입자크기를 표면적 평균직경(d₃₂)과 부피 평균직경(d₄₃)으로 산출했을 때도 발효 혼합곡물이 각각 18.00, 42.43 μm로 혼합곡물(24.52, 69.89 μm)보다 작았다. 이에 따라 입자의 총표면적을 총부피로 나눈 비표면적(specific surface area per volume)에서 발효 혼합곡물은 3,333.53 cm²/cm³로 혼합곡물(2,446.51 cm²/cm³)보다 1.4배 높았다(Table 3). 이 결과들은 혼합곡물의 입자크기가 발효 공정으로 뚜렷하게 감소했음을 보여주는 것으로, 미생물의 효소적 분해작용으로 곡물 속 고분자들이 저분자화된 결과로 해석된다.

Table 3 . Changes in the particle size distribution, water-holding capacity, and viscosity of grain mixture (GM) by lactic acid bacteria fermentation¹⁾.

Physical property		GM	Fermented GM	Significance
Particle size distribution2)
Diameter (μm)	at 10%	9.897	8.382
	at 50%	55.157	33.821
	at 90%	160.812	104.69
Specific surface area per volume (cm2/cm3)		2,446.51	3,333.53
Surface weighted mean diameter d32 (μm)		24.52	18
Volume weighted mean diameter d43 (μm)		69.89	42.43
Water-holding capacity (%)
Cold water (4°C)		174±2	107±4	***
Hot water (82°C)		303±64	165±15	*
Significance		*	**
Viscosity (cP)		3,062±759	909±156	**

¹⁾Data are average±standard deviation of triplicate experiments, except particle size measurement. *, **, and *** mean that the values are significantly different at P<0.05, P<0.01, and P<0.001, respectively..

²⁾Values are the average of 100 scans..

Fig 2. Changes in the particle size distribution (A) and sedimentation index (B) of grain mixture (GM) by lactic acid bacteria fermentation.

발효 혼합곡물의 입자크기 감소는 침강속도 실험 결과에 그대로 반영되었다(Fig. 2B). 각 분말을 증류수와 교반한 후 정치했을 때, 발효 혼합곡물은 혼합곡물보다 상대적으로 느린 속도로 침강하였으며 60초 경과 시 침강지수가 8.09%로 혼합곡물(20.88%)보다 뚜렷이 낮았다. 이는 발효 혼합곡물의 가용성 고형분 함량이 유의적으로 높았던 결과(Table 1) 및 입자크기가 유의적으로 작았던 결과(Fig. 2A, Table 3)와 일치한다. 즉 현탁액 고유의 특성 중 하나인 “중력에 의한 입자의 침강현상”이 발효 혼합곡물에서 감소한 것은, 발효 후 곡물을 구성하는 입자 일부가 교질용액이나 진용액 형성이 가능한 크기로 작아졌음을 의미한다. 이는 앞서 언급한 대로, 유산균 발효 중 효소에 의해 불용성의 고분자 물질이 저분자량의 물질로 분해되어 용액 내에 용해되거나 분산되었기 때문이다.

두 곡물의 물 결합력을 분석한 결과(Table 3), 발효 혼합곡물은 냉수(P<0.001)와 온수(P<0.05) 모두에서 혼합곡물보다 유의적으로 낮았다. 이에 따라 점도 역시 909 cP로 혼합곡물(3,062 cP)보다 유의적으로(P<0.01) 낮았다. 이는 우수한 수분보유력을 지닌 식이섬유가 발효 혼합곡물에서 유의적으로 감소했던 현상과 연관된 것으로 보인다(Table 1). 한편, 두 곡물은 냉수보다 온수에서 유의적으로(P<0.05) 높은 물 결합력을 나타내었는데, 이 현상은 분말이 온수에 분산된 경우 전분 입자 내부로 수분침투 속도가 빨라 전분의 수화가 용이하고, 또한 온수에 의해 전분이 부분적으로 호화된 결과로 해석된다(BeMiller와 Huber, 2007). 발효 혼합곡물에서는 미생물에 의한 효소적 분해작용으로 식이섬유뿐 아니라 다당류인 전분도 감소하게 되어 온수에서도 낮은 물 결합력을 보인 것으로 해석된다.

유산균 발효가 혼합곡물의 산화안정성에 미친 영향

혼합곡물을 산화유도 시스템에 노출해 산화안정성을 평가한 결과는 Fig. 3과 같다. 330분 노출 동안 두 곡물 모두 지방산화의 이차생성물인 MDA 함량은 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나 동일 조건에서 발효 혼합곡물은 혼합곡물보다 MDA 생성량이 유의적으로(P<0.05) 낮아, 발효 후 산화안정성이 개선되었음을 확인해주었다. 이 결과는 혼합곡물 속 환원물질이 전자를 전달하는 능력을 측정한 총환원력 결과와도 일치한다(Table 1). 지방산화는 지방산에 라디칼이 생성되면서 개시되고, 과산화물 생성과 분해를 거쳐 이차산화물인 MDA가 생성된다(McClements와 Decker, 2007). 발효 혼합곡물은 혼합곡물보다 10배 이상 높은 환원력을 보유하고 있었으며, 이는 지방산화의 초기 단계에서 생성된 알킬 라디칼(R･)과 퍼옥시 라디칼(ROO･), 중간단계에서 생성되는 알콕시 라디칼(RO･) 등에 전자를 공여함으로써 지방산화를 지연시켜 MDA 생성을 감소시킨 것으로 해석된다.

Fig 3. Malondialdehyde content induced in grain mixture (GM) and fermented GM when subjected to the oxidation-accelerating system. At the same time point, values are significantly different at P<0.05.

본 연구에서는 곡물기반 새로운 식품원료를 제조하기 위해 콩, 보리, 현미, 밀로 구성된 “혼합곡물”에 유산균 발효 공정을 적용하였다. 3종 복합유산균인 Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus와 비피더스균인 Bifidobacterium longum KCTC 5734를 혼합곡물에 첨가하여 37°C에서 호기적으로 5일 동안 배양한 후 동결건조하여 “발효 혼합곡물”을 제조하였다. 유산균 발효로 제조된 발효 혼합곡물은 혼합곡물과 비교할 때 첫째, 식이섬유와 구성아미노산은 감소하였고 가용성 고형분과 유리아미노산은 증가하였다. 또한 적정산도의 증가로 pH가 감소한 현상이 관찰되었다. 이는 유산균과 비피더스균이 지닌 탄수화물 분해효소와 단백질 분해효소의 작용으로 저분자 물질이 생성되고, 탄수화물 분해로 생성된 포도당이 젖산발효와 bifidus pathway를 거쳐 젖산 및 초산을 생성한 결과로 해석하였다. 둘째, 총환원력은 10배 이상 높았고, 산화유도 시스템하에서는 상대적으로 적은 양의 MDA를 생성함으로써 개선된 산화안정성을 보여주었다. 이 현상은 유산균과 비피더스균이 보유한 β-글루코시다아제의 작용으로 배당체가 산화방지 활성이 더 우수한 비배당체로 전환되었기 때문으로 해석하였다. 셋째, 기능성 아미노산으로 알려진 GABA와 오르니틴 함량은 증가하였고, 이들의 전구체 아미노산인 글루탐산과 아르기닌 함량은 감소하였다. 이는 S. thermophilus와 S. lactis가 지닌 글루탐산 탈탄산효소 활성과 S. lactis가 지닌 아르기닌 디이미나아제 활성으로 해석하였다. 넷째, 물리적 특성으로는 침강지수가 감소하여 혼합곡물보다 우수한 분산성을 보여주었다. 이러한 결과는 혼합곡물에 유산균 발효공정을 적용함으로써 원재료와는 차별된 기능성과 물성을 보유한 새로운 식품소재 개발이 가능할 수 있음을 보여주었다. 본 연구에서 개발된 발효 혼합곡물 소재는 간장의 기능성 강화, 선식의 분산성 개선, 베이커리 제품의 영양성 보강 등의 목적으로 다양한 가공품 생산에 적용될 수 있다.

이 논문은 중소기업청(현, 중소벤처기업부)의 지원을 받아 수행된 산학 공동기술개발지원사업 첫걸음기술개발 연구로 지원에 감사드립니다. 시료 준비와 분석실험에 도움을 준 강원대학교 류다연에게 감사를 드립니다.