심혈관계 질환은 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환으로, 허혈성 심장 질환을 비롯한 여러 심혈관계 질환들이 주요 사망원인 질병 중 하나로 보고된 바 있다(Kim, 2013). 이러한 고위험 심혈관계 질환의 주된 원인으로는 과도한 활성산소에 의한 심근세포 손상이 대표적으로 알려져 있다(Hwang 등, 2021). 활성산소는 정상적인 인체의 대사과정에서 지속적으로 생성되는 부산물이며, 체내 주요 세포 구성 물질인 단백질, 지질, DNA와 반응하여 세포를 손상시킬 수 있는 것으로 보고된다(Ahn 등, 2021). 최근엔 이러한 활성산소종을 감소시켜 산화 스트레스를 개선하고, 심혈관계 질환을 예방할 수 있도록 다양한 항산화 소재들이 연구되고 있다(Shin과 Yang, 2004). 특히 천연물 유래 항산화 물질은 활성산소를 제거하는 데 효과적이고 합성 항산화제에 비해 인체에 무해하여 grom embryonic BDIX rat ventricular heart tissue 유래 세포로 알려진 H9c2 cell과 함께 심혈관계 질환연구에 널리 활용되고 있다(Park 등, 2012; Yoo 등, 2005).

최근 식용곤충의 풍부한 단백질과 생리활성 물질을 기반으로, 대체 식품을 넘어 기능성 식품 소재로서의 가치를 입증하는 연구가 활발히 진행되고 있다(Kim 등, 2019). 농촌진흥청과 식품의약품안전처에서 지정한 국내의 식용곤충은 총 10가지가 있으며, 그중 장수풍뎅이 유충은 단백질 외에도 필수아미노산, 무기질 등을 다량 함유하여 항염증 효과(Lee 등, 2017) 및 항산화 활성(Ryu 등, 2019) 등의 기능성이 알려져 있다(Hong 등, 2022). 하지만 장수풍뎅이 유충의 저온 추출물이 산화 스트레스가 유도된 심근세포에 미치는 영향은 아직 보고된 바 없다.

고단백 식품소재는 가공 시 온도 조건에 따라 영양성분 및 특성에 큰 영향을 받는다(Xu 등, 2015). Mishyna 등(2021)에 의하면 갈색거저리(Tenebrio molitor), 희시무르귀뚜라미(Gryllodes sigillatus) 등의 식용곤충이 지닌 단백질 성분들이 90°C 이상의 고온에서 열처리하였을 때 변성 및 감소하는 것으로 보고된 바 있다. 더불어 저온 추출물이 고온 추출물보다 상대적으로 독성이 낮고 생리활성 물질이 변형되지 않았다는 사실이 보고된 바 있다(Han 등, 2009).

따라서 본 연구에서는 장수풍뎅이 유충 저온 추출물(Allomyrina dichotoma larva extracts, ADLE)의 세포 생존율, 산화방지 효소 활성, 세포사멸 및 항산화 단백질 발현에 미치는 영향에 대해 분석함으로써 산화방지 및 심혈관 질환 관련 기능성 소재로서의 가능성을 평가하고자 한다.

장수풍뎅이 유충 저온 추출물 제조

실험에 사용된 장수풍뎅이 유충은 (주)퓨처푸드랩에서 구매하였다. 장수풍뎅이 유충을 동결건조한 후 분쇄하여 분말화하였으며, 이에 증류수를 가하고 교반 및 가열하여 추출을 진행하였다. 추출물을 거름종이(No. 4, Whatman)로 여과하여 이를 4°C, 1,977×g 조건에서 원심분리한 후 상등액을 얻었다. 이 추출 상등액은 회전 감압농축기를 이용해 농축 후 동결건조하고 -70°C에서 보관하여 본 연구에 사용하였다.

심근세포 H9c2 cell 배양

Embryonic rat에서 유래한 H9c2 cell은 서울 한국세포주은행에서 분양받아 배양하였다. 세포 배양 시 10% FBS (Gibco), 1% antibiotics(100 unit/mL penicillin and 100 unit/mL streptomycin)가 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; Lonza) 배지를 사용하였다. 온도는 37°C, CO₂는 5%를 유지하여 배양하였다.

DPPH를 통한 라디칼 소거 활성 평가

ADLE의 라디칼 소거 활성능을 측정하기 위하여 99% MeOH를 이용하여 시료를 50, 100, 200, 250, 500 및 1,000 μg/mL로 희석한 후 96-well plate에 100 μL씩 분주하였다. 99% MeOH에 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma-Aldrich Co.) 시약을 녹여 0.1 mM 용액을 제조한 후 장수풍뎅이 시료가 분주된 well에 분주하였으며, 30분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

이때 Asample은 sample과 DPPH 반응 용액의 흡광도를 의미한다. Ablank1은 sample의 단독 흡광도를, Ablind는 DPPH 용액의 단독 흡광도를 의미하며, Ablank2는 공시료를 의미한다.

ABTS를 통한 라디칼 소거 활성 평가

ADLE의 자유라디칼 소거 활성능을 측정하기 위하여 최종 농도가 7 mM인 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS, Sigma-Aldrich Co.)와 2.45 mM potassium persulfate를 혼합하였다. 이후 암실에서 방치시킨 후 24시간 뒤에 ABTS 용액의 농도를 760 nm에서 흡광도 값이 0.68~0.72가 되도록 희석시켜 사용하였다. 희석된 ABTS 용액과 ADLE 시료를 96-well plate에 well당 각각 100 μL씩 분주하여 실온에서 15분 동안 방치한 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였다.

이때 Asample은 sample과 ABTS 반응 용액의 흡광도를 나타내며, Ablind는 ABTS 용액의 단독 흡광도를 의미한다.

FRAP을 통한 환원력 평가

ADLE의 환원력(reducing power)을 측정하기 위하여 Benzie와 Strain의 분석방법(1996)을 참고하여 The ferric reducing/antioxidant power(FRAP) assay를 실시하였다. 300 mM acetate buffer(pH 3.6)와 40 mM HCl에 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ, Sigma-Aldrich Co.), 20 mM FeCl₃·6H₂O를 각각 10:1:1의 비율로 섞어서 반응시킨 후 용액을 제조하였다. 이후 well당 시료 100 μL와 FRAP reagent 100 μL씩 넣고 incubator에서 반응시킨 다음 593 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ADLE 처리에 대한 세포 생존율 평가

ADLE와 H₂O₂ 처리가 심근세포의 사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여 H9c2 cell을 96-well plate에 1×10⁴ cells/well이 되도록 분주한 후 16시간 동안 배양하며 완전히 부착시켰다. ADLE를 농도별(50, 100 및 200 μg/mL)로 처리하고 4시간 후에 H₂O₂를 처리한 뒤 6시간 동안 배양하였다. 5 mg/mL의 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetra-zolium bromide(MTT; Sigma-Aldrich Co.) 용액을 제조하여 well당 20 μL를 첨가하여 반응시켰다. 이후 diethyl sulfoxide(Sigma-Aldrich Co.)를 첨가하여 formazan을 녹여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

H9c2 심근세포 내 CAT enzyme 활성 평가

Catalase(CAT) 효소 활성을 평가하기 위해 6-well plate에 1×10⁶ cells/well의 농도로 H9c2 cell을 분주하여 4시간 동안 부착시킨 후 H₂O₂를 150 μM의 농도로, ADLE를 100, 200 μg/mL의 농도로 처리한 후 incubator에서 배양하였다. H9c2 cell을 원심분리하여 상층액을 제거한 후 남은 pellet은 RIPA buffer(Thermo Fisher Scientific Inc.)를 이용하여 cell lysis시켜 원심분리(16,000×g, 20 min)하여 cell lysate를 분리하였다. 이후 bicinchoninic acid(BCA) protein detection kit(Thermo Fisher)을 이용하여 cell lysate의 단백질을 정량하여 sample을 제조하였다. 이후 Catalase assay kit(EMD Millipore Corp.)을 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 CAT 활성을 평가하였다.

H9c2 심근세포 내 SOD 활성 평가

Superoxide dismutase(SOD) 활성을 평가하기 위해 6- well plate에 1×10⁶ cells/well의 농도로 H9c2 cell을 분주하여 4시간 동안 부착시킨 후 H₂O₂를 150 μM의 농도로, ADLE를 100, 200 μg/mL의 농도로 처리한 후 incubator에서 배양하였다. H9c2 cell을 원심분리하여 상층액을 제거한 후 남은 pellet은 NP 40 buffer(Biosource)를 이용하여 cell lysis시켜 원심분리(16,000×g, 20 min)하여 cell lysate를 분리하였다. 이후 BCA assay 분석법을 이용하여 cell lysate의 단백질을 정량하여 sample을 제조하였다. 이후 superoxide dismute(SOD) colorimetric activity kit (Thermo Fisher Scientific Inc.)을 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 SOD 활성을 평가하였다.

ADLE 처리에 대한 웨스턴 블롯 분석

세포사멸 관련 단백질과 항산화 관련 단백질의 발현을 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 6-well plate에 1×10⁶ cells/well의 농도로 H9c2 cell을 분주하여 4시간 동안 부착시킨 후 H₂O₂를 150 μM의 농도로, ADLE를 100, 200 μg/mL의 농도로 처리한 후 incubator에서 배양하였다. H9c2 cell을 원심분리하여 상층액을 제거한 후 남은 pellet은 RIPA buffer를 이용해 lysis시켜 원심분리(16,000×g, 20 min)하여 cell lysate를 분리하였다. 이후 BCA protein detection kit(Thermo Scientific)을 이용하여 cell lysate의 단백질을 정량하였으며, cell lysate를 10~12% SDS- polyacrylamide gel에 각각 10 μg씩 loading 하여 전기영동을 진행하였다. 이후 polyvinylidene difluoride membrane(Millipore Merck KGaA)으로 transfer 하여 5% skim milk로 1시간 동안 blocking을 하였으며, 1차 antibody(Cell Signaling)를 overnight 하여 부착시킨 후 membrane을 5분씩 3번 washing을 진행하였다. 그 후 2차 antibody(goat-anti rabbit lgG, Calbiochem)를 1시간 동안 부착시킨 후 TBST(20 nM tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.5)로 이전 과정과 동일하게 washing을 진행하였다. 이 과정에서 1차 antibody는 1:2,000으로 희석하여 사용하였으며, 2차 antibody는 1:4,000으로 희석해서 사용하였다. 최종 단계에서 SuperSignal West Pico Trial Kit(Thermo Fisher Scientific Inc.)을 사용하여 단백질 발현을 확인하였다. 세포사멸 단백질(cleaved caspase-3, cleaved caspase-9, Bax, Bcl-2)과 항산화 단백질(cytosol Nrf-2와 HO-1)의 결과는 β-actin을 이용하여 정량하였다.

통계분석

모든 실험은 각각 3회씩 진행하여 데이터를 얻었으며, GraphPad Prism version 8.0.1(GraphPad Software Inc.)을 이용하여 Tukey’s multiple comparison test에 따라 one-way ANOVA test로 분석하였다. 시료 간 유의성은 물질을 처리하지 않은 대조군(the negative control group, NC)과 P<0.1, P<0.01, P<0.001 수준에서 비교하였으며, 과산화수소 단독처리군(the positive control group, PC)과 P<0.1, P<0.01, P<0.001 수준에서 비교하였다.

ADLE의 자유라디칼 소거능 평가 및 환원력 평가

DPPH, ABTS 및 FRAP은 자유라디칼 소거능과 환원력을 평가하는 대표적인 항산화 활성 측정법으로, 홀수 전자를 갖고 있어 보라색을 띠는 DPPH는 항산화제와 반응하게 될 경우 환원되어 보라색이 탈색되어 흡광도 값이 감소한다(Cho 등, 2018). DPPH는 천연물의 수소공여능을 간접적으로 측정하여 자유라디칼 소거 능력을 분석할 수 있는 대표적인 항산화 지표이다(Ha 등, 2023). ABTS assay는 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS･+자유라디칼이 항산화제에 의해 소거되어 ABTS 라디칼이 청록색에서 탈색되는 원리를 이용한 방법이다(Choi 등, 2003). 친수성 용매와 유기용매에 녹아 넓은 범위의 시료를 분석할 수 있는 ABTS assay는 높은 재현성과 간단한 방법으로 가장 널리 이용되는 자유라디칼 소거 측정 방법이다(Ko, 2022). FRAP는 철 이온을 환원시키는 능력을 측정하는 항산화 평가 방법으로(Park과 Kim, 2009), 환원력이 강할수록 푸른색을 띠는 원리를 이용한 방법이다(Lee 등, 2016). FRAP 측정법은 DPPH assay 및 ABTS assay와는 달리 산화 및 환원 반응에 의한 활성을 측정하는 방법으로, 재현성이 높고 간단하다는 장점이 있는 것으로 보고된 바 있다(Jang 등, 2019). 자유라디칼 소거 측정 방법인 DPPH assay 및 ABTS assay와 환원력 측정 방법인 FRAP에서 항산화 활성은 유사하게 나타나는 연관성을 갖는 것으로 알려져 있다(Kim 등, 2018b). 이에 더하여 한 가지 방법으로는 정확한 항산화 활성을 분석하기 어려운 것으로 보고된 바 있다(Kim 등, 2018a).

따라서 본 실험에서 DPPH assay. ABTS assay 및 FRAP을 통해 ADLE의 자유라디칼 소거능 및 환원력에 관한 결과를 확인하였다. ADLE는 50, 100, 200, 250, 500 및 1,000 μg/mL의 농도로 처리하였으며, 뛰어난 항산화능을 나타내는 것으로 알려진 ascorbic acid(1 mM)를 양성대조군으로 비교하였다. ADLE의 DPPH 라디칼 소거 능력에 대하여 실험을 진행한 결과, 50, 100, 200, 250, 500 및 1,000 μg/mL의 ADLE를 각각 처리하였을 때, DPPH 라디칼 소거 활성(9.7, 22.7, 28.4, 30.8, 47.8 및 71%)이 유의적으로 증가하였다(Fig. 1A).

Fig 1. The antioxidant activity of Allomyrina dichotoma larvae extract (ADLE) and ascorbic acid (AsA, 1 mM). (A-C) Analyzes of DPPH radical, ABTS radical, and FRAP were performed as described in the materials and methods section. The bar graph indicates the mean±SD (n=3 samples). ^***P<0.001, when compared to the positive control (PC) group.

ADLE의 ABTS 자유라디칼 소거 능력에 대하여 실험을 진행한 결과, 50, 100, 200, 250, 500 및 1,000 μg/mL의 ADLE를 각각 처리하였을 때, ABTS 라디칼 소거 활성(18.8, 33.3, 57.1, 63.1, 94.6 및 100.4%)이 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 1B).

ADLE의 환원력을 알아보기 위하여 FRAP assay를 이용하여 실험을 진행하였다. 앞선 두 가지의 실험과 동일하게 50, 100, 200, 250, 500 및 1,000 μg/mL의 ADLE를 처리한 결과, ADLE의 농도가 증가함에 따라 593 nm에서 측정한 흡광도 값(0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.4 및 0.5 nm)이 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 1C).

이러한 결과를 통해 ADLE의 농도가 증가함에 따라 자유라디칼 소거 능력 및 환원력이 증가하여 항산화 활성이 높아짐을 확인하였다. 더불어 ADLE의 자유라디칼 소거 능력과 환원력이 농도 의존적으로 동일하게 증가한 것을 확인하였다. 앞서 Kim 등(2019)에 따르면 장수풍뎅이 유충을 비롯한 식용곤충 4종의 분리단백과 이에 관한 항산화 활성이 확인된 바 있다. 각각의 분리단백은 높은 항산화능을 나타내었으며 이러한 분리단백에서 필수 아미노산인 Phe와 Trp의 함량이 높은 것으로 밝혀진 바 있다. 이를 토대로 ADLE의 항산화 효능은 다양한 분리단백질에 함유된 아미노산 성분의 영향에 따른 것으로 사료된다.

ADLE의 H9c2 심근세포 보호 효과

MTT assay는 미토콘드리아의 탈수소 작용을 이용하여 세포 내 비수용성의 formazan을 생성시켜 살아있는 세포의 생존율을 측정하는 대표적인 방법이다(Kwak 등, 2013). Lim과 Lee(2008)에 따르면 astaxanthin이 항산화 작용을 통해 과산화수소 처리된 H9c2 cell의 세포 생존율을 회복시켰다고 보고된다. 이러한 선행연구를 토대로 ADLE의 항산화 작용이 과산화수소로 유도된 H9c2 cell 내 세포독성을 완화하는지 확인하였다.

따라서 본 연구를 진행하기에 앞서 장수풍뎅이 유충이 심근세포 내에서 자체적으로 세포독성을 나타내는지 알아보기 위하여 H9c2 심근세포에 ADLE를 농도별(50, 100 및 200 μg/mL)로 처리한 다음, 24시간 후 MTT assay 분석법으로 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과, ADLE를 처리한 모든 농도(50, 100 및 200 μg/mL)에서 ADLE가 세포독성을 나타내지 않았음을 확인하였다(Fig. 2A). 다음으로 H9c2 심근세포에 산화적 손상을 유도하기 위하여 과산화수소를 농도별(50~800 μM)로 처리하였고, 과산화수소의 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 2B). 따라서 이후 실험에서 H₂O₂의 농도를 NC 대비 유의미한 결과를 나타낸 농도(150 μM)로 고정하여 진행하였다. 앞서 독성 여부를 확인한 ADLE가 세포사멸에 미치는 영향을 알아보기 위하여 H9c2 cell에 농도별(50, 100 및 200 μg/mL) ADLE를 16시간 동안 처리하였다. 이후 과산화수소를 6시간 동안 처리하였다. 그 결과, ADLE를 처리한 모든 농도(50, 100 및 200 μg/mL)에서 PC 대비 세포 독성을 완화하는 효과를 나타내었다(Fig. 2C). 더불어 ADLE의 처리 농도에 따라 세포 생존율이 증가함을 확인하였다.

Fig 2. Effect of Allomyrina dichotoma larvae extract (ADLE) and H₂O₂ on growth of H9c2 myoblast cells. (A-C) The cell viability was measured by MTT assay. H9c2 myoblast cells were incubated for 18 h, 6 h along with ADLE and H₂O₂ indicated concentrations respectively. (C) H9c2 myoblast cells were pretreated with ADLE for 4 h and 150 μM H₂O₂ was treated for 2 h. All bar graphs indicate the means±SD (n=3 samples). ^*P<0.1, ^**P<0.01, and ^***P<0.01, compared to the NC group. ^##P<0.01 and ^###P<0.001, compared to the positive control (PC) group.

이러한 결과를 통해 ADLE는 항산화 작용을 기반으로 산화 스트레스에 의한 H9c2 cell의 사멸을 완화한 것으로 사료된다. 이후 실험에서 ADLE의 농도를 항산화 효능과 세포사멸 방지 효능을 두드러지게 나타낸 농도(100, 200 μg/ mL)로 고정하여 진행하였다.

세포 내 산화방지 효소 활성 측정

과산화수소에 의한 산화적 손상은 결국 각종 질병을 야기할 수 있으므로 예방 및 보호하는 것이 특히 중요하다. 이러한 산화적 손상에 대한 방어체계에 관여하는 대표적인 항산화 효소에는 CAT와 SOD가 있다. CAT는 앞선 과정에서 생성된 과산화수소를 H₂O와 O₂로 전환하는 것을 촉진하며, SOD는 유독성의 O₂^-를 과산화수소로 전환시키는 과정에서 촉매로 작용한다(Ji 등, 2013). Tran 등(2023)에 의하면 쌍별귀뚜라미 등의 식용곤충 추출물이 항산화 효소(SOD, CAT)의 활성을 증가시키는 것으로 보고된 바 있다.

본 실험에서 과산화수소에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대하여 ADLE의 H9c2 cell 내 항산화 효소 발현 정도를 알아보고자 CAT와 SOD의 활성을 측정하였다. 100 및 200 μg/mL 농도의 ADLE를 전처리한 후 과산화수소(150 μM)를 가한 다음 H9c2 세포 내

산화방지 효소의 활성을 알아보았다. 그 결과, PC에서는 CAT와 SOD의 활성이 각각 20.5 unit/mg protein, 0.55 U/mL로 나타났지만 과산화수소와 ADLE의 병행처리군에서는 26, 27.4 unit/mg protein 및 1.06, 1.16 U/mL를 나타내며 PC 대비 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 3).

Fig 3. Effect of Allomyrina dichotoma larvae extract (ADLE) on antioxidant enzyme activities in peroxide hydrogen treated H9c2 myoblast cells. (A,B) The antioxidant enzyme activities was measured by catalase assay and SOD assay. H9c2 myoblast cells were incubated for 18 h, 6 h along with ADLE and H₂O₂ indicated concentrations respectively. H9c2 myoblast cells were pretreated with ADLE for 4 h and 150 μM H₂O₂ was treated for 2 h. All bar graphs indicate the means±SD (n=3 samples). ^***P<0.001, compared to the NC group. ^###P<0.001, compared to the positive control (PC) group.

이를 통해 산화적 스트레스는 항산화 효소의 활성을 감소시켰으며, 농도별 ADLE의 처리는 활성산소종을 제거하여 항산화 효소 활성을 회복시킨다는 사실을 확인하였다. 따라서 ADLE 처리는 활성산소종 생성을 억제시켜 세포손상을 방지하는 데 도움을 줄 것으로 생각된다.

웨스턴 블롯 분석을 통한 세포사멸 단백질 발현 확인

Apoptotic pathway에서 주요 역할을 하는 대표적인 단백질에는 Bcl-2, Bax를 포함한 Bcl-2 family, caspase 3, caspase 9이 있다. 산화적 스트레스가 가해지면 ROS는 Bcl-2, Bax 등의 세포사멸 관련 단백질 방출을 유도하고, 이러한 작용으로 caspase 3, 9에 신호가 전달되어 최종적으로 apoptosis를 초래한다(Yuan 등, 2011). 이 과정에서 Bcl-2 familly는 미토콘드리아 외막의 투과성을 조절하여 cell apoptosis 경로를 조절한다(Levine 등, 2008). 그중 Bax와 Bcl-2는 pro-apoptotic 또는 anti-apoptotic 효과를 나타내는 가장 중요한 구성원으로 알려져 있다(Kang과 Reynolds, 2009).

Caspase는 apoptotic pathway에서 활성화되는 주요 조절인자로, caspase-3 및 caspase-9의 활성도를 측정함으로써 apoptosis가 일어난 정도를 알 수 있다. 특히 caspase-9은 초기 apoptosis 과정에서 활성화되어 세포 내 존재하는 많은 단백질의 분해에 관여하는 것으로 알려져 있으며, caspase-9에 신호에 따라 caspase-3가 개시되며 최종적으로 apoptosis가 일어난다(Ahn 등, 2004).

Lee 등(2023)에 의하면 흰점박이꽃무지 유충 추출물이 항산화 작용을 통해 세포사멸 단백질의 발현을 감소시킨 것으로 보고된 바 있다. 이러한 선행연구를 기반으로 ADLE의 항산화 작용이 H9c2 cell 내 세포사멸에 영향을 미치는지 확인하였다. 더불어 과산화수소 처리에 의한 H9c2 cell 사멸이 세포사멸 단백질(Bcl-2, Bax, cleaved caspase-3 및 cleaved caspase-9) 발현으로 인한 apoptosis에 의한 것인지 알아보기 위하여 웨스턴 블롯을 진행하였다. 그 결과, Bax, cleaved caspase-3 및 cleaved caspase-9의 경우, ADLE (100, 200 μg/mL)와 과산화수소(150 μM)의 병행처리군에서 PC 대비 단백질 발현량이 감소하는 것으로 나타났다. Bcl-2 단백질의 경우, ADLE(100, 200 μg/mL)와 과산화수소(150 μM)의 병행처리군에서 PC 대비 단백질 발현량이 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 4).

Fig 4. Effect of Allomyrina dichotoma larvae extract (ADLE) on various proteins’s activation in H₂O₂-treated H9c2 myoblast cells. H9c2 myoblast cells were pretreated with 100 and 200 μg/mL ADLE for 4 h and 150 μm H₂O₂ was treated for 2 h. (A) Expressions of Bcl-2, Bax, cleaved caspase-3, cleaved caspase-9 were evaluated by western blot. (B) The relative band intensity of each protein is expressed as a percentage. The bar graph indicates the mean±SD (n=3 samples). ^*P<0.1, ^**P<0.01, and ^***P<0.001, compared to the NC group. ^##P<0.01 and ^###P<0.001, compared to the PC group.

이러한 결과를 통해 ADLE가 세포사멸을 차단하는 Bcl-2를 활성화시키고, 세포사멸을 유도하는 Bax를 억제시키는 것을 알 수 있다. ADLE의 처리는 활성화된 상태인 cleaved caspase-3와 cleaved caspase-9로 가는 경로를 차단하여 세포사멸을 방지하는 것을 확인하였다. 또한, 과산화수소에 의한 세포사멸 억제는 Bcl-2 family와 caspase의 apoptosis 기전 억제에 의해 일어나는 것임을 확인하였다. 농도별(100, 200 μg/mL) ADLE의 처리는 과산화수소에 의한 세포사멸을 완화시키는 것을 확인하였으며, MTT assay를 통해 확인한 세포보호 효과는 Bax, cleaved caspase-3, 9의 활성 억제에 영향을 받은 것으로 사료된다.

웨스턴 블롯 분석을 통한 항산화 단백질 발현 확인

활성산소종 제거 및 관련 유전자 발현에 관여하는 대표적인 단백질에는 cytosol Nrf-2와 HO-1이 있다. Cytosol Nrf-2는 항산화 효소를 조절하는 주요 항산화 조절인자 중 하나이며, HO-1은 cytosol Nrf-2의 표적인자이다(Kwon 등, 2018). 기저 상태에서 Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)과 결합하는 cytosol Nrf-2는 산화적 스트레스가 가해지면 Keap1에서 방출되어 단백질량이 증가하게 된다. 이후 세포질에서 핵 내로 이동된 Nrf-2는 항산화 반응을 하는 부위에 접합하게 되고, 이 과정에서 항산화 단백질을 발현시켜 HO-1이 반응하게 된다(Kim 등, 2020; Yang 등, 2017). HO-1은 cytosol Nrf-2의 발현에 영향을 받으며, ROS를 제거하고 생체 내에서 heme를 이용하여 항산화 작용을 하는 biliverdin 등의 부산물들을 생성시켜 항산화 작용을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Jeon 등, 2020).

Park 등(2018)에 따르면 굼벵이 추출물의 처리가 Nrf-2/ HO-1 signaling pathway를 조절하여 산화 스트레스를 감소시켰으며, 이를 기반으로 세포사멸을 완화시켰다고 보고된다. 이러한 선행연구를 토대로 항산화능을 지닌 ADLE가 cytosol Nrf-2와 HO-1의 항산화 기작을 통해 세포사멸 보호 효과를 나타내는지 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 그 결과, cytosol Nrf-2의 경우 ADLE(100, 200 μg/mL)와 과산화수소(150 μM)의 병행 처리군에서 PC 대비 단백질 발현량이 감소하는 것으로 나타났다. HO-1의 경우, ADLE(100, 200 μg/mL)와 과산화수소(150 μM)의 병행처리군에서 PC 대비 단백질 발현량이 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 5). 이를 통해 ADLE의 H9c2 cell 내 산화방지 작용 기작은 cytosol Nrf-2와 HO-1의 항산화 작용 기작에 영향을 받는 것임을 확인하였다. 또한, 농도별(100, 200 μg/mL) ADLE의 처리를 통해 cytosol Nrf-2의 발현이 감소하고, HO-1의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. cytosol Nrf-2의 발현이 감소한 것을 통해서 세포질에 있던 Nrf-2가 핵 내로 이동하여 nucleo Nrf-2가 증가했음을 예측할 수 있다. 앞서 농도별 ADLE 처리에 따라 세포사멸을 촉진하는 단백질은 억제되고, 세포사멸 억제 단백질은 활성화된 것을 확인하였다. 이와 더불어 항산화 단백질의 발현이 증가한 것을 통해 ADLE가 심근세포 내 산화 스트레스를 감소시킴으로써, 심혈관계 질환을 예방하는 데 도움을 줄 수 있다고 생각된다.

Fig 5. Effect of Allomyrina dichotoma larvae extract (ADLE) on various proteins’s activation in H₂O₂-treated H9c2 myoblast cells. H9c2 myoblast cells were pretreated with 100 and 200 μg/mL ADLE for 4 h and 150 μm H₂O₂ was treated for 2 h. (A) Expressions of HO-1, cytosol Nrf-2 were evaluated by western blot. (B) The relative band intensity of each protein is expressed as a percentage. The bar graph indicates the mean±SD (n=3 samples). ^**P<0.01 and ^***P<0.001, compared to the NC group. ^##P<0.01 and ^###P<0.001, compared to the PC group.

본 연구에서는 장수풍뎅이 유충 저온 추출물(ADLE)의 세포사멸 보호 효과 발휘 여부를 항산화능과 세포사멸 신호전달 활성 측정을 통해 알아보았다.

먼저 H9c2 cell에 ADLE (100 및 200 μg/mL)를 처리하고 과산화수소(150 μM)를 처리하여 ADLE의 세포사멸 보호 효과를 확인한 결과, ADLE가 과산화수소 처리에 의한 세포독성을 완화하는 것을 확인하였다. 또한, ADLE의 산화방지능을 측정하기 위해 DPPH, ABTS, FRAP assay를 통해 라디칼 소거능과 환원력을 측정하였으며, CAT와 SOD를 통해 산화방지 효소의 활성도를 측정하였다. 그 결과, DPPH, ABTS, FRAP 세 실험에서 시료의 농도가 증가함에 따라 라디칼 소거능과 환원력이 증가하였다. CAT와 SOD 측정 결과, PC 대비 ADLE와 과산화수소 병행처리군에서 높은 산화방지 효소 활성이 나타났다. 다음으로 ADLE가 과산화수소 처리로 유도된 세포사멸에 관여하는 단백질의 활성을 감소시키는지 알아보기 위하여 웨스턴 블롯을 실행하였다. 그 결과, 과산화수소의 처리는 Bax 및 cleaved caspase의 활성을 증가시키고 Bcl-2의 활성을 감소시켜 최종적으로 H9c2의 사멸을 유도하는 것을 확인하였다. 이에 ADLE의 병행처리는 Bax 및 cleaved caspase의 apoptosis 기전을 억제하여 세포사멸을 방지하는 것으로 나타났다. 마지막으로 웨스턴 블롯을 통해 항산화 기작을 하는 단백질의 활성이 과산화수소로 유도된 세포사멸에 영향을 미치는지 알아보았다. 그 결과, ADLE 병행 처리군에서 PC 대비 HO-1의 발현이 증가하고 cytosol Nrf-2의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 ADLE에 의한 세포사멸 보호효과는 산화방지 효소의 작용을 통한 산화 스트레스 감소에 의한 것으로 사료된다. 이를 통해 ADLE는 라디칼 소거능과 환원력을 기반으로 과산화수소가 처리된 H9c2 cell 내 산화방지 효소를 활성화시키는 것으로 나타난다. 또한, ADLE가 과산화수소로 유도된 산화 스트레스를 감소시켜 세포사멸을 완화하는 것으로 사료된다. 이를 토대로 장수풍뎅이 유충 저온 추출물의 항산화 및 세포사멸 보호 효과를 나타내는 기능성 소재로서의 활용 가능성을 제시한다. 하지만 장수풍뎅이 유충 추출물의 생리활성 기능을 나타내는 성분을 명확하게 규명할 수 없으므로 후속 연구가 필요한 실정이다.

본 연구는 2022년도 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기본연구사업(No. NRF- 2022R1F1A1063850)으로 수행되었으며, 그 지원에 감사드립니다.