뼈는 신체 구조를 지지하고 대사적 측면에서 일생에 걸쳐 재구성이 일어나는 매우 역동적인 장기다(Florencio-Silva 등, 2015). 뼈는 조골세포, 파골세포, 골세포 등 다양한 세포로 구성되어 있고, 특히 뼈를 형성하는 조골세포와 뼈를 흡수하는 파골세포의 균형을 통해 뼈의 질을 유지하게 된다(Kohli 등, 2018; Seeman, 2009). 이 중에서 조골세포는 중간엽 줄기세포로부터 분화되며, 분화는 세포의 증식, 기질의 성숙, 세포외 기질의 무기질화를 거쳐 진행되고, 다양한 세포 내 신호전달 경로를 통해 조절된다(Kim 등, 2020; Stein 등, 2004). 조골세포 분화는 호르몬과 여러 가지 호르몬 및 사이토카인에 의해서 조절되는데 대표적으로 bone morphogenetic proteins와 같은 사이토카인에 의해 분화 초기 유전자인 distal-less homeobox 5(Dlx5), runt-related transcription factor 2(Runx2)가 발현하고, alkaline phosphatase(ALP)와 같은 효소 작용에 의해 분화가 진행된다(Beederman 등, 2013; Majidinia 등, 2018). 분화 후기에는 osteocalcin(OC), osterix, bone sialoprotein(BSP)과 같은 유전자들의 발현이 증가하게 된다(Cao 등, 2015; Roth 등, 1999).

Quercetin은 딸기, 사과 그리고 양파를 포함하는 다양한 채소 및 과일에 함유된 식물성 플라보노이드계 물질이다(Di Petrillo 등, 2022; Shorobi 등, 2023). Quercetin의 알려진 기능으로는 자유 라디칼을 소거하고 내인성 항산화 효소의 발현을 증가시켜 산화 스트레스를 억제하는 항산화 기능이 있다(Hai 등, 2020; Saeed 등, 2017). 그리고 다양한 암세포에서 성장 억제 및 세포 사멸을 유도하는 항암효과가 있다(Gong 등, 2018; Lan 등, 2017). 그뿐만 아니라 염증성 사이토카인의 분비를 억제하는 항염증 효과도 보고된 바가 있다(Bhaskar 등, 2016; Costa 등, 2016; Formica와 Regelson, 1995; Kim과 Park, 2016). 이러한 기능을 바탕으로 quercetin은 연골 세포의 염증 및 세포 사멸을 억제하여 골관절염을 억제하기도 하고, 중간엽 줄기세포에서 조골세포 분화를 증가시킨다는 보고도 있다(Oh, 2020; Wang 등, 2023).

최근까지도 식물 유래 천연물은 조골세포 분화를 촉진할 수 있음이 밝혀지고 있고, 그중에서 특히 플라보노이드계 물질은 뼈의 형성에 있어서 긍정적인 효과가 있다는 보고가 있다(An 등, 2016; Weaver 등, 2012). 뿐만 아니라 여러 형태의 quercetin 유사체 및 대사체에 의한 생리활성 효과도 보고되고 있다(Messer 등, 2015; Sharan 등, 2011). 우리는 이전에 quercetin과 그의 gallic acid 짝지음 화합물 3종을 합성하였다(Jang과 Kang, 2019). 합성한 quercetin 유사체들은 quercetin의 3’-, 3-, 7- 수산기에 gallic acid를 에스터 결합으로 짝지은 화합물이며, Q-176, Q-183, Q-192로 명명하였다. Quercetin과 그의 유사체들은 다양한 질병에 효과가 있음이 보고되었지만, quercetin과 그의 합성한 quercetin gallic acid 짝지음 화합물들에 대한 조골세포 분화에서의 연구는 진행된 바가 없다.

본 연구에서는 quercetin의 유사체가 조골세포 분화에 미치는 영향을 알아보고, quercetin과 비교하여 그 효능을 검증하고자 하였다. 이를 위해 조골전구세포주인 MC3T3-E1에 quercetin과 그 유사체를 처리하여 조골세포 분화 표지 유전자의 발현을 확인하였고, ALP 활성 및 세포외 기질의 무기질화도 확인하였다. In vivo 수준에서의 효과는 zebrafish의 꼬리지느러미의 재생을 통해 quercetin과 그 유사체의 효능을 평가하였다.

세포 배양

마우스 두개골 유래 조골전구세포주인 MC3T3-E1 세포는 ATCC에서 구입하여 사용하였다. 배양 유지 시에는 α- MEM(GibcoBRL) 배지에 10% FBS(Atlas Biologicals)와 1% 항생제(100 U/mL penicillin-100 μg/mL streptomycin, Gibco BRL)를 첨가하여 37°C, 5% CO₂ 조건에서 세포를 배양하였다.

Quercetin 유사체 합성

우리는 quercetin과 그의 gallic acid 짝지음 화합물 3종을 합성하였다(Fig. 1). Quercetin의 3’-수산기에 gallic acid가 결합된 Q-176은 선행연구의 방법으로 합성하였다(Thapa 등, 2012). Quercetin-3-gallate인 Q-183은 quercetin dihydrate로 3단계의 반응으로 합성하였고, quercetin-7-gallate인 Q-192는 quercetin에서 4단계의 반응으로 합성하였다(Jang과 Kang, 2019). Quercetin의 각 수산기는 반응성의 차이가 있으며, 일반적으로 3-, 7-, 4’-, 3’- 수산기의 순서로 반응이 일어난다. 5-수산기는 4-카보닐기와의 분자 내 수소결합으로 인하여 반응성이 상당히 낮다. 우리는 3종의 quercein gallic acid 짝지음 화합물을 합성하기 위하여 각 수산기의 반응성 차이를 이용하였으며, quercetin과 quercetin dihydrate의 반응성 차이도 이용하였다.

Fig 1. Structures of quercetin and quercetin analogs (Q-176, -183, and -192). Structures of (A) Quercetin, (B) Q-176, (C) Q-183, and (D) Q-192.

Quercetin 및 quercetin 유사체에 대한 세포독성 시험

Quercetin(Sigma-Aldrich Co.) 및 각 유사체(Q-176, Q-183, Q-192)가 세포 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay를 수행하였다. MC3T3-E1 cell을 48-well plate에 well당 2×10⁴개로 접종하여, quercetin과 그 유사체를 각 1, 2, 5, 10, 20 μM의 농도로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 그 후, MTT(Sigma-Aldrich Co.)를 0.5 mg/mL의 농도로 처리하여 같은 조건에서 1시간 30분 동안 배양한 후 배지를 제거하고 불용성 formazan 결정을 dimethyl sulfoxide(Duchefa)로 용해시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

유전자 발현 분석법

Quercetin 및 각 유사체가 조골세포 분화 표지 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 quercetin 및 각 유사체(10 μM)를 처리하여 1, 2, 4일 동안 배양하였다. 배양한 세포는 dPBS로 세척 후, TRI-solution(Bioscience Technology)을 이용하여 MC3T3-E1 세포에서 총 RNA를 추출 및 분리하였다. 2 μg RNA를 TOP script™ RT Dry MIX (Enzynomics)를 이용하여 complementary DNA(cDNA)를 합성하였다. Emerald Amp GT PCR Master Mix(TaKaRa Bio Inc.)와 primer가 포함된 혼합물 19 μL와 cDNA 1 μL를 polymerase chain reaction(PCR) cycle을 25~30회 수행하였다. PCR 반응 조건은 95°C에서 10분, 95°C에서 30초, 각 유전자의 어닐링 온도에서 30초, 72°C에서 30초 후 다시 95°C, 30초로 반복되는 cycle을 반복하고 72°C에서 5분을 수행하였다. 중합 효소 반응에 쓰인 primer의 정보는 Table 1과 2에 나타내었다.

Table 1 . Oligonucleotide sequence of mouse primer (RT-PCR).

Gene	Forward primer	Reverse primer
Dlx5	ATGAAGGTCGCCAGTGGCAGT	ACTTTGCGGTTCTGGGGCAGG
Runx2	CCGCACGACAACCGCACCAT	CGCTCCGGCCCACAAATCTC
β-Actin	TTCTTTGCAGCTCCTTCGTTGCCG	TGGATGGCTACGTACATGGCTGGG

Table 2 . Oligonucleotide sequence of mouse primer (qPCR).

Gene	Forward primer	Reverse primer
Dlx5	GCCCACCAACCAGCCAGAGA	CCGCACGACAACCGCACCAT
Runx2	AGATGACATCCCCATCCATC	GCGAGGTACTGAGTCTTCTGAAACC
β-Actin	TTCTACAATGAGCTGCGTGTG	GTGAGGGATGAAATGCTGG

Alkaline phosphatase 염색 분석

24-Well plate에 MC3T3-E1 세포를 5×10⁴개로 접종하고 quercetin 및 각 유사체를 처리하여 7일 동안 배양하였다. 이후 배양액을 제거하고 PBS로 세척하여 4% formaldehyde로 5분간 실온에서 고정했다. 세포의 고정이 끝난 후 BCIP®/NBT(Sigma-Aldrich Co.)로 10분간 염색하고 3차 증류수로 3회 이상 세척하였다.

골의 석회화 측정

MC3T3-E1 세포를 24-well plate에 5×10⁴개로 접종하여 quercetin 및 각 유사체를 각각 처리하여 3주간 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 dPBS로 세척하여 4% formaldehyde로 5분간 실온에서 고정했다. 세포를 고정한 후 2% Alizarine Red Solution(ARS, Sigma-Aldrich Co.)으로 5분간 염색하고 3차 증류수로 3회 이상 세척하였다.

Zebrafish 사육관리

본 연구에서 사용한 zebrafish(Danio rerio)는 성체로 판단되는 몸길이 3.4~4.4 cm에 해당하는 개체를 사용하였다. 물 300 mL, 30±1°C, 낮/밤주기 12시간 조건에서 한 수조당 2~3마리의 zebrafish를 유지하여 사육했다. 매일 Artemia nauplii(Artemia salina)와 Tetra bits complete를 급여하였고, 물은 2~3일 간격으로 교체하였다. 본 실험은 대구대학교 실험동물관리 및 이용위원회(DUIACUC-12020/4- 0313-006)의 승인을 받아 진행하였다.

Zebrafish 꼬리지느러미의 골 기질 염색

Quercetin과 그 유사체에 대한 zebrafish의 꼬리지느러미 재생을 확인하기 위해 ARS 염색을 수행하였다. Zebrafish를 사육하는 물에 quercetin과 그 유사체를 10 μM의 농도로 처리하여 7일 동안 사육하였다. Zebrafish는 10% formaldehyde 용액을 이용하여 24시간 동안 고정하였다. 무기질화의 시각화를 위해 zebrafish는 1% KOH(Sigma- Aldrich Co.)와 3% H₂O₂(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 12시간 동안 침연시켰다. 그 이후에 25% sodium tetraborate(Sigma-Aldrich Co.)를 2시간 동안 처리한 다음 물로 세척하여 ARS 염색을 진행하였다.

통계처리

본 연구에서 얻은 결과는 평균±표준오차로 표시하였고, 통계처리는 Student’s t-test를 이용하였으며, P<0.05, P< 0.01, P<0.001인 경우 대조군과 quercetin 및 각 유사체 처리군 사이에 유의성이 있음을 인정하였다.

MC3T3-E1 세포에서 quercetin 및 그 유사체의 세포독성

MC3T3-E1 세포는 마우스 두개골 유래의 조골전구세포주로 조골세포 분화와 관련된 연구에서 대표적으로 사용되는 세포다(Hwang과 Horton, 2019; Wang 등, 1999). Quercetin 및 그 유사체가 MC3T3-E1 세포에서 독성을 나타내지 않는 농도를 알아보기 위해 MTT assay를 수행하여 세포독성 여부를 평가하였다. Quercetin 및 그 유사체(Fig. 1)를 2일간 각각 1, 2, 5, 10, 20 μM의 농도로 처리한 결과 quercetin에서는 20 μM의 농도에서 독성이 나타났으나 유사체의 처리에서는 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(Fig. 2). 따라서 이후 실험에서는 10 μM의 농도를 사용하였다.

Fig 2. Effects of quercetin and quercetin analogs on the viability of MC3T3-E1 cells. (A, B, C, and D) Cell viability was determined using the MTT assay. MC3T3-E1 cells were seeded in 48-well plates (5×10⁴ cells/well) and treated with concentrations of quercetin and quercetin analogs (1, 2, 5, 10, and 20 μM) for 2 days. Statistical significance was determined relative to the control by Student’s t-test (^*P<0.05). Data represent the mean±SEM of three individual experiments.

Quercetin 및 그 유사체가 조골세포 분화 표지 유전자의 발현에 미치는 영향

Quercetin은 중간엽 줄기세포에서 조골세포 분화를 증가시킨다는 연구 결과가 있었고, TNF-α 및 LPS에 의해 저해되는 조골세포 분화를 회복시킨다는 보고도 있었다(Bian 등, 2021; Wang 등, 2014; Zhang 등, 2021).

본 연구에서는 조골전구세포주인 MC3T3-E1에 quercetin 및 그 유사체를 처리하여 조골세포 분화 표지 유전자의 발현을 알아보았다. 먼저 10 μM 농도의 quercetin을 1, 2, 4일 동안 처리한 결과 2일 차에 조골세포 분화 표지 유전자인 Dlx5와 Runx2의 발현이 가장 높은 것을 확인하였다(Fig. 3A).

Fig 3. Quercetin and quercetin analogs increase the expression of major osteogenic markers in MC3T3-E1 cells. (A) MC3T3- E1 cells were treated with quercetin (10 μM) for 0, 1, 2, and 4 days. mRNA levels of Dlx5 and Runx2 were measured by RT-PCR. (B and C) MC3T3-E1 cells were treated with quercetin and quercetin analogs (10 μM) for 2 days. mRNA levels of Dlx5 and Runx2 were measured by RT-PCR and real-time PCR. (D) MC3T3-E1 cells were treated with quercetin and quercetin analogs (10 μM) for 2 days. Protein levels of Dlx5 and Runx2 were measured western blotting. Data represent the mean±SEM of three individual experiments and determined relative to control by Student’s t-test (^**P<0.01). And compared with the quercetin-treated group by Student’s t-test (^#P<0.05, ^##P<0.01, ^###P<0.001).

Quercetin과 비교하여 그 유사체들이 조골세포 분화에 미치는 결과를 확인한 결과 querctin 유사체(Q-176, Q-183, Q-192) 모두 quercetin에 비해 Dlx5와 Runx2 mRNA 발현이 증가하였다(Fig. 3B,　3C). Western blot 실험 결과에서도 quercetin에 비해 그 유사체들이 Dlx5와 Rnux2의 단백질 수준을 더욱 증가시키는 결과를 나타냈다(Fig. 3D). Dlx5는 조골세포 분화 과정에서 발현되는 유전자로 Runx2의 프로모터에 결합하여 전사를 조절하고 조골세포 분화 후기 유전자인 OC의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Franceschi 등, 2007; Komori, 2005). Runx2는 조골세포 분화에 있어서 핵심 유전자로서 조골세포 분화 초기에 많이 발현되며 후기 유전자로 알려진 OC, BSP, type 1 collagen 등의 발현을 증가시킨다(Marie, 2008). Runx2 결핍 마우스의 경우 후기 유전자 발현의 저해로 인해 조골세포 분화가 진행되지 않는다고 보고되었다(Komori 등, 1997). 본 결과는 quercetin은 이미 알려진 바와 같이 조골세포 분화 표지 유전자들의 발현을 증가시켰지만, 그 유사체들은 quercetin보다 조골세포 분화 표지 유전자들의 발현을 더욱 증가시킨다는 것을 확인한 것이다.

Quercetin 및 그 유사체가 ALP 활성 및 무기질화에 미치는 영향

세포막에 존재하는 당단백질 효소인 ALP는 조골세포 분화 과정 중에 탈인산화로써 무기 인산을 운반하고 세포외 기질에 인산칼슘의 침착을 통한 석회화를 유도하는 데 기여한다(Redlich 등, 2002; Schiller 등, 2001). 기존 연구와 마찬가지로 quercetin은 ALP 활성을 증가시켰다. 또한 quercetin 유사체는 quercetin보다 ALP 활성을 더 증가시킨 것을 확인하였다(Fig. 4A). 조골전구세포에서 조골세포로 분화하게 되면 세포외 기질에 뼈기질 성분인 인산칼슘을 합성하여 침착시켜 뼈형성을 증가시킨다.

Fig 4. Quercetin and quercetin analogs increased Alkaline phosphatase (ALP) activity and alizarin red S (ARS) staining in vitro and in vivo. (A and B) MC3T3-E1 cells were treated with quercetin and quercetin analogs (10 μM) for 7 days or 3 weeks in 24-well plates (2×10⁴ cells/well). and stained for ALP and with ARS, respectively. Data represent the mean±SEM of three individual experiments. Statistical significance was determined relative to the control by Student’s t-test (^*P<0.05, ^**P<0.01). And compared with the quercetin-treated group by Student’s t-test (^#P<0.05, ^##P<0.01, ^###P<0.001).

Alizarin red S는 칼슘에 특이적인 결합을 하는 식물성 염료로 세포외 기질에 침착된 칼슘에 결합하여 무기질화를 평가할 수 있다(Redlich 등, 2002). Quercetin 유사체는 quercetin과 비교했을 때 무기질화를 증가시켰다(Fig. 4B). 기존 연구에 따르면 자연적으로 발생하는 quercetin의 유사체가 조골세포 분화 과정에서 세포외 기질의 무기질화를 증가시킨다는 보고가 있었다(Siddiqui 등, 2011). 그리고 본 연구에 사용된 quercetin 유사체는 gallic acid와 짝지어져 있고, gallic acid는 단독으로도 ALP 활성 및 무기질화를 증가시키는 것으로 보고된 바가 있다(Oh 등, 2021). 그러므로 quercetin과 gallic acid의 화합물인 quercetin 유사체가 ALP 활성 및 무기질화를 기존의 quercetin에 비해 더 증가시키는 것으로 사료된다. 본 결과는 quercetin보다 그 유사체가 ALP 활성 및 무기질화를 더 증가시켜 조골세포 분화를 촉진함을 나타내었다.

Quercetin 및 그 유사체가 zebrafish 꼬리지느러미 재형성에 미치는 영향

Zebrafish의 꼬리지느러미 줄기는 조골세포로 구성되어 있고, 절단된 꼬리지느러미의 재생에 있어 조골세포 분화는 필수적으로 발생한다(Geurtzen 등, 2014). 재생 과정에서 zebrafish의 지느러미는 손상된 뼈의 수복 근원이 되는 조골전구세포가 조골세포로 분화되면서 진행된다(Knopf 등, 2011). 따라서 zebrafish의 꼬리지느러미가 재생된다는 것은 조골세포의 분화로 볼 수 있다(Kim 등, 2022; Lim 등, 2021). Quercetin과 그 유사체가 손상된 zebrafish 꼬리지느러미의 재생을 증가시키는지 확인하기 위하여 quercetin과 그 유사체를 처리하여 ARS 염색을 진행하였다. 그 결과 quercetin은 zebrafish의 꼬리지느러미 재생을 증가시켰고, 그 유사체는 quercetin에 비교했을 때 재생을 더 증가시킴을 확인하였다(Fig. 5). 이는 in vivo 수준에서도 quercetin과 그 유사체가 조골세포 분화를 증가시킴을 나타낸다. 본 연구에서는 quercetin과 그 유사체가 in vitro 및 in vivo 수준에서도 조골세포 분화를 증가시킴을 확인하였다. 하지만 quercetin과 그 유사체에 대한 신호전달의 분자적 기전에 관한 후속 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.

Fig 5. Quercetin and quercetin analogs increases regeneration of zebrafish fins. (A and B) Caudal fin rays of adult zebrafish were amputated on day 0, and ARS staining was performed. Total caudal-fin rays and the enlarged region are shown at the top and bottom, respectively. Caudal fin rays of adult zebrafish were cut, treated with quercetin or quercetin analogs (100 μM) for 7 days, and stained with ARS. Scale bar, 200 mm. Data are represented as mean±SEM for three individual experiments and determined relative to control by Student’s t-test (^**P<0.01). And compared with the quercetin-treated group by Student’s t-test (^##P<0.01). The zebrafish image was taken from the picture gallery site. Data represent the mean±SEM of three individual experiments.

본 연구에서는 quercetin 및 그 유사체가 조골세포 분화에 미치는 영향에 대해 고찰해 보았다. MTT assay를 통해 quercetin 유사체가 MC3T3-E1 세포에서 독성을 나타내지 않음을 확인하였고, 조골세포 분화 표지 유전자인 Dlx5와 Runx2의 발현을 mRNA 및 단백질 수준에서 증가함을 확인하였다. ALP 염색 및 ARS 염색을 통해 quercetin 유사체가 ALP 효소 활성과 세포외 기질의 무기질화를 증가시켰음을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 zebrafish를 이용한 in vivo 실험에서도 quercetin 유사체가 zebrafish의 꼬리지느러미 재생을 증가시키는 것을 통해 조골세포 분화를 증가시킴을 확인하였다. 본 연구에서 quercetin 유사체는 quercetin보다 효과가 뛰어남을 확인하였고, 이러한 결과들은 quercetin 유사체가 quercetin에 비해 조골세포 분화를 더 촉진하여 골 관련 질환 예방 및 치료에 있어서 가능성을 나타내는 것으로 생각된다.

이 결과물은 2020년도 대구가톨릭대학교 학술연구비 지원에 의한 것임. 2021년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임(No.2021R1F 1A1062502).