발효는 유용한 미생물인 probiotics가 당질, 단백질 또는 지방 등을 이용하여 유기산, 알코올, CO2 등의 발효산물을 생성하는 과정이다. 식품은 암 발생 및 암 예방에 중요한 역할을 하며, 특히 식품 속에 있는 phytochemical과 이를 probiotics 균으로 발효한 발효식품은 미생물에 의해 발효된 postbiotic metabolites의 함량이 증진된다. 또한 postbiotics와 식품 내 phytochemical의 발효산물은 강력한 항암효과를 나타낼 수 있다(Park, 2012). 발효의 주 역할을 하는 발효 미생물은 주로 probiotics 균으로 유산균, 고초균, 황국균 등이 있으며, 이들이 식품을 발효하여 건강에 유리한 발효산물을 생성하고 정장 작용을 하는 등 발효식품은 건강 유지에 중요한 역할을 한다. 또한 병원성균이 잘 자라지 못하게 하므로 건조식품같이 식품의 저장성을 증진시켜 안전성을 확보하는 역할도 한다(Park, 2012).

유니테인(Unitein)은 콩에 홍삼을 혼합해 Bacillus subtilis 균으로 발효시킨 다음, salvesterol-Q40이 들어있는 진피와 섞어 한 번 더 발효시킨 발효식품이다. 유니테인은 항암효과와 면역력을 향상시키는 효과를 가지며, 이는 in vivo 종양 억제실험을 통해 확인되었다(Kim, 2011). 9증9포 홍삼은 사포닌 성분을 최대한 추출하여 인체의 흡수율을 평균 13%에서 80%까지 높여 홍삼의 효능을 강화했다. 진피에는 카로티노이드, 플라보노이드, 리모닌, 식이섬유 등이 다량 함유되어 있으며(Chung 등, 2000), Aureobasidium pullulans로 발효한 진피에서 배당체 형태의 플라보노이드가 aglycon으로 전환됨으로써 플라보노이드의 기능성이 강화된 것으로 확인되었다(Park 등, 2012). 청국장의 재료인 대두에는 리신과 트레오닌 등 필수아미노산이 다량 들어있어(Song 등, 2021), 혈중 콜레스테롤양을 낮춰주어 동맥경화, 심근경색, 뇌졸중 및 고혈압 등을 예방하여 치료식으로도 이용한다. 또한 대두에는 이소플라본인 제니스틴 및 다이드진이 다량 함유되어 있으며, 이를 발효시키면 aglycone 형태의 제니스테인과 다이드제인이 되면서 항암효과 등이 증진된다(Park과 Jung, 2005). 진피는 항암 한약재로 많이 쓰이며, limonene과 salvesterol-Q40 등의 활성물질이 있는 것으로 알려져 있다(Tan 등, 2007; Adeniyi 등, 2017). 또한 대두, 홍삼과 진피를 발효한 추출물은 항염증 효능이 우수하다는 보고도 있다(Lee 등, 2015).

심층수(deep seawater)는 일반적으로 수심 200 m 이상의 해수를 말한다. 심층수는 표층수에 비해 순도, 저온 및 풍부한 미네랄을 함유하는 것이 특징이며, Mg, Ca, K 등 미네랄의 함량이 표층수에 비해 많다(Nakasone과 Akeda, 1999; Katsuda 등, 2008). 심층수는 고지혈증, 고혈압, 알레르기성 피부 반응의 완화 예방 효과 및 항비만과 항당뇨 효과도 가지고 있음이 확인되었다(Yoshioka 등, 2003; Paolisso와 Barbagallo, 1997; Kimata 등, 2001; Hwang 등, 2009). 소금 중 신안천일염(Park 등, 2021) 및 죽염과 천일염(Ju 등, 2017)은 마우스 실험에서 대장암을 억제한다고 하였으며, 심층수 미네랄도 인체 유방암세포에서 항암효과가 있다고 발표된 바 있다(Kim 등, 2013). 그러므로 소금의 미네랄 구성 성분이 항암 활성에 중요한 인자라고 볼 수 있다.

유니테인은 in vivo에서 종양 억제 효과만 연구되었고 항암 메커니즘과 이에 따른 염증 억제 효과가 연구되지 않았다. 또한, 심층수염 미네랄은 현재 (주)미바라이트에서 개발하고 있는 항암 제품이므로 이를 혼합 및 활용하여 HT-29 결장암세포에 대한 항암효과를 확인하고자 하였다. 따라서 본 연구는 HT-29 인체 대장암세포에서 MTT 및 RT-qPCR을 이용한 mRNA 유전자 발현 확인을 통해 유니테인 및 심층수염 미네랄의 항암 및 항염증 효과에 관련된 메커니즘을 보고 유니테인에 심층수염 미네랄 첨가에 의한 항암 증진 효과를 연구하였다.

대장암은 대장 내벽(결장 및 직장)에서 발생하는 악성종양으로, 한국에서는 2~3위, 미국에서는 세 번째로 흔한 악성종양이며 암 관련 사망의 주요 원인 중 하나이다(Karousi 등, 2020). 이로 인해 대장암 치료는 세계의 관심사 중 하나이지만, 대장암의 구체적인 발병기전은 복잡하고 명확하지 않다. 기존 연구에 따르면 암세포는 통제되지 않는 증식의 특징을 가지므로 종양 세포의 과도한 증식을 억제하는 것이 항암제 개발의 핵심적인 방법의 하나이다(Zhang 등, 2016). 암의 발현 메커니즘에 대해서는 cell cycle, apoptosis, inflammation, angiogenesis 및 DNA repair 등 DNA 복구 유전자의 근본적인 결함으로 인해 게놈 불안정성과 돌연변이율 증가 등이 관련되어 있다(Davis와 Milner, 2007). 세포 증식 및 DNA 손상은 세포 주기 진행(cell cycle)을 정지시켜 복제 결함의 복구 및 예방을 진행하거나 치명적인 돌연변이 세포를 제거하기 위해 세포자멸사(apoptosis)를 활성화할 수 있다(Sancar 등, 2004). 이는 anti-apoptosis인 Bcl-2나 Bcl-xL의 발현을 낮추고 pro-apoptosis인 Bax 또는 Bak 등의 상향 조절을 통해 이루어진다(Chen과 Kong, 2005). 이때 일어나는 anti-apoptosis 및 pro-apoptosis 사이의 불균형은 미토콘드리아 막에서 cytochrome c의 방출을 유도하고, 이는 caspase 3, 6 및 7의 활성화와 함께 caspase 9과 복합체를 형성한다(Watson과 Fitzpatrick, 2005). 또한, 활성화된 caspase는 세포 내 단백질을 분해하여 형태학적 변화와 세포사멸을 유발한다(Thornberry와 Lazebnik, 1988). Inflammation은 유해한 자극에 대한 신체 조직의 적응 반응이며 감염, 조직 손상 및 자가면역의 경우에 발생하는 복잡하고 중요한 생리학적, 병리학적 반응이다(Almeer 등, 2019). 또한, 다양한 암 진행 단계의 발달 및 조절에서 염증의 역할이 나타난다(Hussain과 Harris, 2007). 이에 따라 본 연구에서는 유니테인 및 심층수염 미네랄을 이용하여 HT-29 대장암세포 증식 억제 효과 및 항염증 작용기전을 연구하였다.

시료 제조

유니테인, 비발효 유니테인 및 해양 심층수염 미네랄은 (주)미바라이트(Seoul, Korea)에서 공급받았다. 유니테인의 경우 대두를 삶아서 42~45°C의 온도를 유지하는 발효실에 넣고 48시간 동안 1차 발효시킨 후, 대두 중량의 5~10%가 되도록 홍삼 분말을 혼합하여 함수량을 조정하고 25시간 2차 발효시켰다. 대두와 홍삼 혼합 발효물은 진피 분말을 25:75 중량비로 혼합하여 18시간 동안 3차 발효한 후에 제분하였다(Kim, 2011). 비발효 유니테인은 발효과정을 거치기 전 혼합된 분말을 사용하였다. 심층수염 미네랄은 강원도 고성지역의 해양 심층수로 제조되었으며, 미네랄 농도는 100 g당 Na 29.64 g, Mg 3,893 mg, Ca 988 mg, K 992 mg 등이었다. 각 샘플을 분말 형태로 만든 후 분말 30 g당 20배에 해당하는 600 mL 메탄올을 첨가하고, 교반기로 48시간 동안 교반시켜 유니테인 메탄올 추출물을 얻었다. 메탄올 추출물은 감압농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축시킨 후 파우더 형태로 만들어 dimethyl sulfoxide(DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 250 mg/mL로 만든 후 실험에 사용하였다(Bong 등, 2013).

암세포 배양

HT-29 인체 대장암세포(HT-29 human colon carcinoma cells)는 한국세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 분양받았으며, 세포배양을 위해 사용한 RPMI 1640, fetal bovine serum(FBS)은 Welgene Inc.(Daegu, Korea)로부터 구입하고, 0.05% trypsin-0.02% EDTA와 100 units/mL penicillin-streptomycin은 Gibco BRL(Rockville, MD, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 세포배양은 RPMI 1640에 100 units/mL penicillin-streptomycin과 10%의 FBS를 혼합한 배지를 사용하였고 5% CO₂ incubator로 배양하였다. 배양된 암세포는 일주일에 2~3회 refeeding 하며, 2~3일 후에 phosphate buffered saline으로 세척한 후 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부착된 세포를 탈착하여 원심분리하였다. 원심분리 후 집적된 암세포와 배지를 피펫을 이용하여 잘 혼합한 후 cell culture flask에 10 mL씩을 주입하고, 2~3일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다(Yu 등, 2020).

MTT assay 실험을 이용한 세포 성장 및 성장 억제율 측정

배양된 HT-29 인체 대장암세포를 cell counter(Luna automated cell counter; Logos Biosystems, Gyeonggi, Korea)를 이용하여 세포 수를 측정하고 96-well plate에 well당 2.0×10⁴ cells/mL가 되도록 100 μL씩 분주하여 24시간 동안 배양했다. 이후 유니테인 및 심층수염 미네랄(deep seawater salt mineral, DSM)이 함유된 배지를 세포에 48시간 동안 처리하고, 5 mg/mL 농도의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)를 혼합시킨 배지를 well당 100 μL 첨가하고 4시간 동안 반응시켰다. 반응 이후 형성된 formazan은 DMSO를 이용해 용해시켜 암실에서 30분 동안 반응시키고, Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter(Perkin-Elmer, Wellesley, MA, USA)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다(Pan 등, 2019).

RT-qPCR을 이용한 세포 내 암 관련 유전자 mRNA 발현 측정

배양된 HT-29 인체 대장암세포는 cell counter(Luna automated cell counter; Logos Biosystems)를 이용하여 세포 수를 측정하고 well당 5.0×10⁴ cells/mL의 세포들을 6-well plate에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. HT-29 암세포는 Unfermented Unitein 1 mg/mL(UU), Unitein 1 mg/mL(Uni), Unitein 1 mg/mL+DSM 0.025 mg/mL(UL), Unitein 1 mg/mL+DSM 0.1 mg/mL(UH)가 함유된 배지를 첨가하여 48시간 동안 처리하였다. 이후 배지를 제거하고 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 세포로부터 RNA를 분리하고, 0.1% diethyl-pyrocarbonate(DEPC)에 용해시켰다. 용해된 총 RNA는 NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, DE, USA)을 이용하여 정량하고, 정량된 RNA는 Superscript II reverse transcriptase(Invitrogen)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA는 thermal cycler BioRad CFX -96 real time system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 유전자 발현을 분석하였다(Pan 등, 2019). 유전자로는 p53, p21, Bad, Bim, Bak, Bax, Bcl-2, caspase 9, caspase 3, NF-κB p65, NF-κB p50, COX-2와 GAPDH를 사용하였고, 사용한 primer 서열은 Table 1과 같다.

Table 1 . Primer sequences of RT-qPCR assay.

Gene name	Primer sequence
p53	F: 5′-ATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3′
	R: 5′-TGCAGGGGCCGCCGGTGTAG-3′
p21	F: 5′-ATGTCAGAACCGGCTGGGG-3′
	R: 5′-GCCGGGGCCCCGTGGGA-3′
Bad	F: 5′-CAATGACCCCTTCATTGACC -3′
	R: 5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG -3′
Bim	F: 5′-AGATCCCCGCTTTTCATCTT -3′
	R: 5′-TCTTGGGCGATCCATATCTC -3′
Bak	F: 5′-TCTGGCCCTACACGTCTACC -3′
	R: 5′-AGTGATGCAGCATGAAGTCG -3′
Bax	F: 5′-TGCTTCAGGGTTTCATCCAG -3′
	R: 5′-GGCGGCAATCATCCTCTG-3′
Bcl-2	F: 5′-AAGATTGATGGGATCGTTGC-3′
	R: 5′-GCGGAACACTTGATTCTGGT-3′
Caspase-9	F: 5′-CTAGTTTGCCCACACCCAGT-3′
	R: 5′-CTGCTCAAAGATGTCGTCCA-3′
Caspase-3	F: 5′-TTTTTCAGAGGGGATCGTTG-3′
	R: 5′-CGGCCTCCACTGGTATTTTA-3′
NF-κB p65	F: 5′-ATGGCAGACGATGATCCCTAC-3′
	R: 5′-CGGAATCGAAATCCCCTCTGTT-3′
NF-κB p50	F: 5′-CTGGAAGCACGAATGACAGA-3′
	R: 5′-TGAGGTCCATCTCCTTGGTC-3′
IκB-α	F: 5′-GACACGTGTGGCCATTGTAG-3′
	R: 5′-AACCTGCAGCAGACTCCACT-3′
COX-2	F: 5′-GGTGCCTGGTCTGATGATG-3′
	R: 5′-TGCTGGTTTGGAATAGTTGCT-3′
GAPDH	F: 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′
	R: 5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′

통계처리

MTT 및 RT-qPCR 데이터는 Graph Pad Prism 9.4.1(GraphPad, San Diego, CA, USA)을 이용하여 분석하였으며 모든 실험의 데이터는 평균±표준편차(standard deviation)로 표시하였다. Two-way ANOVA(analysis of variance) 및 one-way ANOVA를 Duncan’s multiple range test를 이용하여 각 그룹 간의 유의성을 확인하였다. P<0.05 이하일 때 유의성이 있다고 간주했으며, SPSS v18 statistical software package(SPSS Inc., Westlands, Hong Kong)를 이용하여 모든 실험 데이터를 분석하였다.

유니테인 및 유니테인 원료의 농도별 HT-29 성장 억제 효과

식품은 발효과정을 통해 항산화, 항암 및 알레르기 억제 효과가 높아진다고 알려져 있다(Park과 Lee, 2019). 이를 통해 발효된 유니테인(Unitein, Uni) 및 비발효 유니테인(Unfermented Unitein, UU)의 암세포 성장 저해 효과를 비교하기 위해 HT-29 대장암세포를 이용하여 MTT assay를 수행하였다. 실험 결과 0.5~1.5 mg/mL 모든 범위 내 Uni군의 HT-29 암세포 억제율이 UU군보다 유의적으로 높게 나타났으며, 농도 의존적으로 성장 억제율이 증가하였다(Fig. 1). 1.25 mg/mL 이상의 농도에서는 Uni의 대장암세포 억제율이 42.34±0.95%였으며, 16.88±5.64%를 나타내는 UU에 비해 큰 차이를 보였다(P<0.0001). 이는 발효되지 않은 것보다 김치, 장류 등과 같이 발효를 거치면 항암효과가 증가하는 경우와 비슷하였다(Bong 등, 2013). 40% 이상의 억제율에서는 정상세포에도 독성을 가진다고 판단하여(Yu 등, 2021) 14.34±1.64% 및 25.72±0.82%의 억제율을 가지는 1 mg/mL의 농도를 선정하여 이후 실험을 진행하였다.

Fig 1. Inhibition rate of HT-29 colon cancer cells according to the unfermented Unitein and Unitein. UU, unfermented Unitein; Uni, Unitein. The *, **, ***, **** symbols mean significantly different P<0.05, P<0.01, P<0.001, P<0.0001, respectively, by Two-way ANOVA.

심층수염 미네랄 농도별 HT-29 성장 억제 효과 분석

Ham 등(2008)은 해양 심층수염을 활용한 고추장을 이용하여 일반세포에는 영향이 적으며 암세포 성장 억제율이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이를 참고하여 심층수염 미네랄의 단독 HT-29 대장암세포의 성장 억제율을 MTT assay를 수행하여 확인하였다. 농도 의존적으로 성장 억제율이 증가했으며, 1.0 mg/mL 농도에서는 100% 암세포 성장이 억제되었다. 0.2 mg/mL 농도의 경우 32.68±1.99%를 나타냈으며, 0.25 mg/mL에서는 52.15±0.97%의 성장 억제율을 보였다(P<0.05)(Fig. 2). 본 실험에 있어 0.2 mg/mL의 농도에서 40% 이하의 암세포 성장 억제율을 보였으므로 유니테인 및 DSM의 혼합에 있어서 DSM의 혼입량을 0.2 mg/mL 이하로 정하여 실험하였다.

Fig 2. Inhibition rate of HT-29 colon cancer cells according to the deep seawater salt minerals. Means with the different letters (a-f) on the bars are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

유니테인 및 심층수염 미네랄 혼합물의 HT-29 성장 억제 효과

유니테인 및 심층수염 미네랄 혼입량에 따른 HT-29 암세포 성장 억제율을 MTT assay를 이용하여 확인하였다. 심층수염 미네랄 단독 HT-29 성장 억제율을 참고하여 1 mg/mL 유니테인에 대한 심층수염 미네랄 혼입량은 0.2 mg/mL 이하인 20% 이하로 기준을 잡았다. 심층수염 미네랄은 유니테인 1 mg/mL에 대해서 1.25~20%인 0.0125~0.2 mg/mL로 실험하였다. 이는 w/v 퍼센트 농도로써 전체 중 0.00125~0.02%에 해당한다. 20% 혼입량의 경우 61.86±2.39%의 성장 억제율을 보였다(Fig. 3). 1.25% 및 2.5%의 경우 27.91±5.31% 및 31.75±1.38%의 HT-29 암세포 성장 억제율을 보였으며, 5%의 경우 37.28±7.46%로 나타났다(P<0.05). DSM 10% 처리 시 40.79±2.41%를 보였으며, 이는 DSM 0.1 mg/mL에서의 억제율 6.29±1.27%, 유니테인 1 mg/mL의 억제율 25.72±0.82%를 더한 32.01±2.09%에 비해 시너지 효과가 있는 것을 확인하였다. 이는 발효를 통한 콩의 aglycone인 제니스테인 함량 등의 증가와 홍삼의 사포닌, DSM이 가지는 미네랄 등 다양한 천연물의 혼합에 의해 항암효과가 높아진 것으로 생각된다(Kwak 등, 2007; Kim 등, 2009). 1.25% 및 2.5%, 5% 및 10%에서 통계적 유의성이 없어(P>0.05) 심층수염 미네랄 혼입량에 따른 저농도 2.5%, 고농도 10%를 선정하여 차후 실험을 하였다.

Fig 3. Inhibition rate of HT-29 colon cancer cells according to the mixing amount of Untein and deep seawater salt minerals. Means with the different letters (a-e) on the bars are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test. Mineral 0∼20% means 0∼0.20 mg/mL. ‘+’ means 1 mg/mL Unitein added.

Cell cycle 관련 유전자 p53 및 p21 mRNA 발현

세포가 증식할 때는 M→G1→S→G2가 반복되면서 세포의 분열이 일어난다. 암의 증식을 억제할 때 cell cycle을 arrest 하여 암세포의 증식을 억제하게 된다(Kastan과 Bartek, 2004). p21은 p53에 의해 활성화되고 cyclins/CDKs의 활동을 억제하는 역할을 한다. p53은 cell cycle arrest와 apoptosis에 관여하는 유전자로 세포막이 스트레스를 받게 되면 p21에 관련하여 cell cycle arrest를 활성화하며 apoptosis 관련 유전자인 Bax를 활성화하고 Bcl-2 발현을 억제하여 세포의 apoptosis에 관여하게 된다. p53과 p21 유전자는 G1, S, G2/M기 전반에 걸쳐 세포의 분열에 관여하며 이 유전자의 양을 측정함으로써 항암제와 같은 물질이 암세포의 분열을 얼마나 억제하는지 확인할 수 있다(Vermeulen 등, 2003; Otto와 Sicinski, 2017).

UU 및 Uni, Uni+DSM 모두 p53 및 p21의 mRNA 발현량을 유의적으로 증가시켰으며(Table 2), p53의 mRNA 발현량은 UU 2.74±0.15, Uni 4.66±0.33, UL 6.26±0.76, UH 9.17±0.37로 Uni의 경우 Con군보다 4.66배, UL 및 UH는 6.26배와 9.17배 mRNA 발현량을 증가시켰다(P<0.05). p21의 경우 UU는 1.27±0.02, Uni 1.92±0.06, UL 3.15±0.06 및 UH 5.88±0.07로 UH는 Con군보다 약 6배 높게 나타났다(P<0.05). Cell cycle arrest 관련 유전자는 UU보다 발효된 Uni에서 높게 나타났으며, DSM을 첨가한 UH에서 cell cycle 억제율이 가장 높은 것으로 확인되었다. 이로써 발효 유니테인의 cell cycle 억제율이 비발효 유니테인보다 유의적으로 높은 것으로 나타났으나 DSM 첨가로 인한 시너지 효과를 통해 cell cycle 억제율을 더 높일 수 있는 것으로 보인다.

Table 2 . Effects of Unitein and deep seawater salt minerals on mRNA expression levels of p53 and p21 in HT-29 cancer cells.

	p53	p21
Con	1.00±0.13e	1.00±0.09e
UU	2.74±0.15d	1.27±0.02d
Uni	4.66±0.33c	1.92±0.06c
UL	6.26±0.76b	3.15±0.06b
UH	9.17±0.37a	5.88±0.07a

Con, no treatment; UU, unfermented Unitein, 1 mg/mL; Uni, Unitein, 1 mg/mL; UL, Unitein (1 mg/mL)＋deep seawater salt minerals low (2.5%, 0.025 mg/mL); UH, Unitein (1 mg/mL)＋deep seawater salt minerals high (10%, 0.1 mg/mL)..

Fold ratio: Gene expression/GAPDH×control numerical value (Control fold ratio＝1)..

Means with the different letters (a-e) at the top right of the numbers are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test..

Apoptosis 관련 유전자 mRNA 발현

Bax, Bcl-2, Bak, Bim 및 Bad 발현: 세포사멸은 암에 대한 중요한 방어 수단이다. B세포 림프종 유전자 2(Bcl-2 유전자)의 발견은 암의 발달이 조절되지 않은 세포분열뿐만 아니라 프로그램된 세포사멸 또는 세포자멸사에 대한 내성의 동시 획득이 필요하다. 대부분의 세포에서 아폽토시스는 미토콘드리아 의존 경로에 의존하며, 이는 Bcl-2 계열의 친아폽토시스(pro-apoptosis) 및 항아폽토시스(anti-apoptosis) 구성원에 의해 조절된다(Hersey와 Zhang, 2003). 적은 양의 세포사멸은 암과 자가면역질환을 촉진하고, 과다한 세포사멸은 허혈 상태를 가중해 신경 퇴행성 변화를 일으킬 수 있다. 그러나 일반적으로 세포자멸사를 유도하는 것은 암 치료에 중요한 기작 중 하나이다. Bcl-2 family는 세포사멸을 결정하고, 세포의 발달, 조직 항상성 및 면역에 중요하다(Czabotar 등, 2014). Apoptotic 세포사멸은 Bcl-2 단백질 패밀리의 생존(pro-survival) 구성원(Bcl-2, Bcl-xL 등)과 사멸 촉진(pro-apoptotic) 구성원의 두 하위 그룹(Bax/Bak-유사 단백질 및 BH-3 전용 단백질, 즉 Bcl-2 단백질 패밀리의 Bim 및 Bad) 간의 복잡한 상호 작용에 의해 조절된다(Kelly와 Strasser, 2011).

RT-qPCR에 의해 pro-apoptotic 유전자 Bax, Bak, Bim, Bad 및 anti-apoptotic 유전자인 Bcl-2의 상대적 mRNA 발현에 대한 유니테인 및 DSM의 효과를 측정했다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 유니테인 처리군은 Con, UU에 비해 Bax, Bak, Bim 및 Bad의 mRNA 발현이 유의하게 증가하였고 Bcl-2의 발현을 현저히 감소시켰다(P<0.05). 동시에 UL군에서 Uni에 비해 pro-apoptotic 유전자의 유의적 증가, anti-apoptotic 유전자의 유의적 감소를 확인했으며, 특히 UH에서 가장 높은 Bax, Bak, Bim 및 Bad 유전자 발현이 증가하였고 Bcl-2 유전자 발현이 가장 많이 감소하는 것을 확인하였다(P<0.05). 유니테인은 apoptosis에 관여하는 유전자를 조절하여 HT-29 암세포의 증식을 억제할 수 있으며, 유니테인과 DSM의 상호작용을 통해 HT-29 세포의 증식을 더 크게 억제할 수 있는 것으로 확인되었다.

Fig 4. Effects of Unitein and deep seawater salt minerals on mRNA expression levels of Bax, Bim, Bad, Bak, and Bcl-2 in HT-29 cancer cells. Con, no treatment; UU, unfermented Unitein, 1 mg/mL; Uni, Unitein, 1 mg/mL; UL, Unitein (1 mg/mL)＋deep seawater salt minerals low (2.5%, 0.025 mg/mL); UH, Unitein (1 mg/mL)＋deep seawater salt minerals high (10%, 0.1 mg/mL). Fold ratio: Gene expression/GAPDH×control numerical value (Control fold ratio＝1). Means with the different letters (a-e) on the bars are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

Caspase 9 및 caspase 3 mRNA 발현: Caspase-cascade system은 세포 내 세포사멸 신호의 유도, 전달 및 증폭에 중요한 역할을 한다. Caspase는 역할에 따라 세포자멸사 활성화제(예: caspase 2, 8, 9), 세포사멸수행자(예: caspase 3, 6, 7) 및 염증 매개체(예: caspase 1, 4, 5) 3가지 아과로 나뉜다(Fan 등, 2005). Caspase-9은 caspase-3를 절단하여 세포자멸사를 시작한다(Geng 등, 2017).

Fig. 5에서 알 수 있듯이 caspase 9 및 caspase 3 내 Con군의 mRNA 발현량이 가장 낮았으며, UU군 사이에는 유의한 차이가 없었다(P>0.05). Uni의 경우 caspase 3에서 1.19±0.01, caspase 9은 1.31±0.09로 상향 조절되었다. UL 및 UH군은 Uni군에 비해 높은 유전자 발현을 보였으며, caspase 3에서 UH군의 발현은 Con군보다 2배가량 증가하였다(P<0.05). 따라서 유니테인은 caspase-cascade의 조절에 관여함으로써 HT-29 암세포 증식을 억제하고 있음을 알 수 있으며, DSM의 첨가로 유니테인에 비해 상승효과를 가지는 것으로 나타났다.

Fig 5. Effects of Unitein and deep seawater salt minerals on mRNA expression levels of caspase 9 and caspase 3 in HT-29 cancer cells. Con, no treatment; UU, unfermented Unitein, 1 mg/mL; Uni, Unitein, 1 mg/mL; UL, Unitein (1 mg/mL)＋deep seawater salt minerals low (2.5%, 0.025 mg/mL); UH, Unitein (1 mg/mL)＋deep seawater salt minerals high (10%, 0.1 mg/mL). Fold ratio: Gene expression/GAPDH×control numerical value (Control fold ratio＝1). Means with the different letters (a-d) on the bars are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

염증관련 유전자 NF-κB p50, NF-κB p65, IκB-α및 COX-2의 mRNA 발현

NF-κB family는 NF-κB1(p105/p50), NF-κB2(p100/p52), RelA(p65), RelB 및 c-Rel의 5가지 구성원으로 되어있다(Bonizzi와 Karin, 2004). NF-κB는 염증반응 조절, 면역체계 조절(immune modulation), 세포자멸사, 세포증식, 상피세포의 분화(epithelial differentiation) 등에 관여하는 단백질군으로 이루어져 있다(Chae, 2015). NF-κB p65/p50의 방출은 암 발달의 필수 과정인 세포증식, 이동 및 염증에 영향을 미치는 표적 유전자의 전사를 촉진하여 핵 전위를 촉진하며(Jana 등, 2017), 대장세포에서 NF-κB의 활성화는 염증성 분자 생성을 증가시키고 대장염 및 대장암을 초래한다고 보고되었다(Karin 등, 2002). IκB-α는 NF-κB 단백질의 핵 국소화 신호를 막아 세포질에서 비활성 상태로 격리해 NF-κB를 억제한다(Jacobs와 Harrison, 1998). 또한 IκB-α는 NF-κB의 적절한 기능에 필요한 NF-κB 전사인자가 DNA에 결합하는 능력을 차단한다(Verma 등, 1995). COX는 COX-1, COX-2의 2가지 동위효소로 분류할 수 있다. COX-2는 정상세포에서 거의 발현되지 않고 사이토카인, 성장인자, 호르몬, 유사분열 등의 자극으로 유도되며 염증세포나 암세포에서 발현되는 것으로 밝혀졌다(Han 등, 2010). COX-2의 과발현은 vascular endothelial growth factor 및 epidermal growth factor receptor와 같은 다양한 혈관신생인자의 합성에 관여하여 종양의 성장과 진행에 중요한 역할을 한다(Gallo 등, 2001; Tsujii 등, 1997).

NF-κB p50 mRNA 발현 또한 모든 군에서 유의적으로 감소했고(Table 3), UU의 경우 Con군에 비해 1.33배 감소하였으며, Uni(0.61±0.02), UL(0.46±0.06) 및 UH(0.31±0.03) 모두 염증반응을 유의적으로 억제하는 것으로 확인되었다(P<0.05). NF-κB p65의 경우 Con군에 비해 전체적으로 감소하였으나, UU 및 Uni의 경우 0.84±0.07 및 0.83±0.09로 발효에 의한 p65 유전자 발현 정도에서는 차이가 없었으며, DSM을 첨가한 UL 및 UH군에서는 0.60±0.09, 0.44±0.06으로 심층수염 미네랄 첨가에 의해 p65의 생성을 억제하였다(P<0.05). IκB-α의 경우 증가하는 경향을 보였으나 모든 군에서 유의적 차이가 없었고 다른 유전적 요인에 의해 NF-κB family의 발현이 억제된 것으로 보이며, 향후 연구가 더 필요한 것으로 보인다. COX-2의 mRNA 발현은 Con군에 비해 모든 군에서 유의적으로 감소하였으며, 유니테인의 경우 Con군에 비해 3.1배 감소한 0.33±0.01의 발현 수준을 보였다(Table 3). 유니테인에 DSM을 혼합한 UL 및 UH의 경우 각각 0.22±0.03, 0.10±0.01의 발현 수준을 나타냈으며, Con군에 비해 각각 4.5배, 10배가량 유의적으로 감소하였다(P<0.05).

Table 3 . Effects of Unitein and deep seawater salt minerals on mRNA expression levels of NF-κB p50, NF-κB p65, IκB-α, and COX-2 in HT-29 cancer cells.

	NF-κB p50	NF-κB p65	IκB-α	COX-2
Con	1.00±0.06a	1.00±0.11a	1.00±0.24a	1.00±0.04a
UU	0.75±0.07b	0.84±0.07b	1.20±0.21a	0.52±0.04b
Uni	0.61±0.02c	0.83±0.09b	1.23±0.11a	0.33±0.01c
UL	0.46±0.06d	0.60±0.09c	1.25±0.35a	0.22±0.03d
UH	0.31±0.03e	0.44±0.06d	1.42±0.16a	0.10±0.01e

Con, no treatment; UU, unfermented Unitein, 1 mg/mL; Uni, Unitein, 1 mg/mL; UL, Unitein (1 mg/mL)＋deep seawater salt minerals low (2.5%, 0.025 mg/mL); UH, Unitein (1 mg/mL)＋deep seawater salt minerals high (10%, 0.1 mg/mL)..

Fold ratio: Gene expression/GAPDH×control numerical value (Control fold ratio＝1)..

Means with the different letters (a-e) at the top right of the numbers are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test..

이 연구에서 대두, 홍삼 및 진피를 발효시켜 만든 유니테인의 항암 및 염증 억제율이 비발효된 샘플에 비해 높은 효과를 보였다. 대두 이소플라본 배당체 형태인 제니스틴, 다이드진은 발효과정을 통해 비배당체인 제니스테인 및 다이드제인으로 전환되며(Kim과 Yoon, 1999), 유니테인의 metabolic 분석 결과를 통해 제니스테인과 다이드제인 같은 물질들이 증가한 것을 확인했다(자료 미제시). 또한 대두발효추출물을 이용하여 lipopolysaccharide(LPS)로 유발한 생쥐 방광염 모델에서 방광 조직 내의 염증반응과 TNF-α의 발현을 감소시켰다(Yoon, 2015). Lee 등(2015)은 대두, 홍삼과 진피로 발효한 발효추출물이 LPS로 유도된 염증을 억제하는 효과가 나타났다고 하였다. 진피의 경우 발효를 통해 플라보노이드의 기능성이 강화되고 발효홍삼은 다른 진세노사이드와 사포닌의 조성 및 함량을 가지는데, 일반홍삼에 비해 높은 항산화 효과를 가지는 등 생리활성의 증가를 나타낸다(Lee 등, 2006). 이를 바탕으로 Bacillus subtilis를 활용한 발효를 통해 유니테인의 염증 억제 및 항암효과가 증진된 것으로 생각한다. Ju 등(2016)은 죽염과 천일염은 마우스를 이용한 대장암 실험에서 염증성 사이토카인의 발현을 유의적으로 감소시켰다고 하였다. 또한, 1%의 신안산 천일염(Park 등, 2021)과 죽염 등은 마우스에서 대장암 발생을 크게 억제하였다(Ju 등, 2017). DSM을 포함한 UL 및 UH의 경우 단순 유니테인을 사용한 것보다 더 높은 염증 억제율을 보였는데 이는 DSM에 포함된 미네랄 성분들이 염증 억제와 항암 활성에 큰 영향을 미친다고 생각된다. 특히 심층수 미네랄에 다량 함유된 Mg 및 Ca의 결핍은 암과 암전이의 위험 증가와 관련이 되어 있으며, 최근에는 심층수 미네랄이 유방암 침습 및 전이에 대해 억제 효과가 있음이 확인되었다(Kim 등, 2013).

따라서 본 실험 결과를 종합해볼 때 유니테인의 경우 발효과정을 통한 여러 성분의 변화에 의해 HT-29 암세포에 높은 성장 억제 효과(MTT)를 나타낸 것으로 보인다. 또한 유니테인 및 심층수염 미네랄의 혼합을 활용했을 때, 기존 유니테인 및 심층수염 미네랄을 단독 사용한 것보다 더 높은 항암 및 염증 억제율을 나타내었다. 이를 통해 유니테인 및 심층수염 미네랄을 활용한 시너지 효과가 기대되며 이는 새로운 기능성 발효식품으로 활용할 수 있다고 생각된다.

본 연구에서는 유니테인(콩, 홍삼과 진피의 발효물) 및 심층수염 미네랄(deep seawater salt minerals, DSM)을 이용하여 기능성 발효제품을 제조했을 때 항암 및 항염증 기능성의 효과를 확인하였다. 유니테인의 경우 비발효 유니테인보다 높은 HT-29 암세포 성장 억제율을 보였으며, 단독 DSM 또한 0.2 mg/mL 농도에서 32.68±1.99%의 높은 암 억제율을 보였다. Cell cycle arrest 관련 유전자인 p53 및 p21에서 Con군에 비해 다른 군 모두 유의적으로 높은 유전자 발현을 보였으며, 특히 유니테인 및 고농도 DSM이 혼합된 UH의 경우 p53에서 Con군보다 10배가량 증가할 정도로 가장 높은 수준을 보였다(P<0.05). Apoptosis 관련 유전자인 Bim, Bad, Bak, caspase 3 및 caspase 9 유전자 발현은 모두 Con 및 UU보다 Uni, UL 및 UH에서 유의적으로 높은 수준을 보였다. 다만 Bax에서는 UU의 발현량이 Uni 및 UL과 비슷하게 나타났으나 UH의 경우 Con군에 비해 3배가량 높은 수준을 보였다. Anti-apoptosis인 Bcl-2 유전자 또한 UH군이 가장 낮은 수준을 보여 모든 그룹 중 UH군이 가장 높은 대장암 억제 효과를 나타내었다(P<0.05). 염증 관련 NF-κB p50, NF-κB p65 및 COX-2의 유전자 발현은 Con군보다 모든 그룹에서 유의적으로 감소했다(P<0.05). 따라서 비발효된 유니테인보다 발효과정을 거쳐 제조된 유니테인의 경우 apoptosis를 현저히 증가시키며 COX-2 및 NF-κB 발현을 감소시켜 대장암 및 염증을 억제한 것으로 보인다. 또한 유니테인에 추가된 DSM 천연물 혼합으로 항암 및 항염증 기능성이 증진되었다.

본 연구는 (주)라이프투게더의 지원을 받아 수행하였으며 이에 감사를 드립니다.