더덕(Codonopsis lanceolata)은 초롱꽃과(Campanulaceae)에 속하는 다년생 초본으로 우리나라를 포함하여 중국, 일본 등 동아시아에서 재배되고 있다. 2019년 기준 국내 생산량은 약 13,255톤이고 생산액은 2,187억 원이며, 강원도, 제주특별자치도가 주산지이다(Lee 등, 2021). 더덕은 참더덕, 양유근으로도 불리며 뿌리, 줄기, 잎 부위가 식품 원료로 사용이 가능할 뿐 아니라 한방에서는 강장, 해열, 거담, 해독작용 등의 목적으로 사용되어왔다(Kim 등, 2008).

더덕은 다른 산채류에 비해 칼륨, 칼슘, 인 등의 무기질과 비타민 B1, 비타민 B2 함량 등이 풍부하여(Hong 등, 2006) 식품학적으로 우수한 식재료이다. 더덕의 기능 성분으로는 triterpene saponin 계열의 lancemasides, codonopoilates, codonoposides, polyacetylene 계열의 lobetyol, lobetyolin, lobetyolinin과 phenylpropanoid 계열의 tangshenosides 등의 대사체가 보고되어 있다(Hwang 등 2018; Kim 등, 2019). 특히 lancemaside A, lobetyolin과 tangshenoside Ⅰ은 더덕의 대표성분으로 알려져 있다(Ichikawa 등, 2009; An 등, 2021). 더덕의 생리활성 연구로는 항산화와 tyrosinase 저해(Kim 등, 2019), 항염증(Jung과 Ryu, 2018), 자궁경부암, 간암, 유방암, 폐암 등을 포함한 항종양 효과(Kim 등, 2009), 면역 작용 증진(Suh, 1996), 고지방식이로 인한 혈청과 간의 중성지질 및 총 콜레스테롤 축적 억제(Han 등, 1998) 등의 연구 결과가 보고된 바 있다.

더덕의 경우 가식부 100 g 기준 껍질 폐기율은 약 24%로, 이는 같은 뿌리 작물인 도라지 폐기율의 2배 수준이다(RDA, 2016). 국제적으로 탄소중립과 관련하여 농식품 산업에서도 식품가공 및 농업 부산물의 새로운 용도를 찾고 가치를 높이고자 다양한 연구가 진행되고 있다. 더덕 뿌리의 껍질 부위는 과육 부위에 비해 일반성분과 페놀산 함량이 높다는 연구 결과가 있었으며(Kang, 2009; Won과 Oh, 2007), Kim 등(2021c)은 복숭아 껍질이 과육에 비해 안토시아닌, 카로티노이드, 비타민 C 함량이 유의적으로 높았음을 밝혔다. 또한 Kim 등(2021b)은 사과 껍질의 procyanidin B2, C1 함량이 과육에 비해 유의적으로 높았다고 보고하였다. 뿐만 아니라 오렌지, 키위, 바나나, 포도 등 다양한 과일 껍질의 비타민 C, 폴리페놀, 플라보노이드 함량과 항산화 효과(Lee 등, 2012), 양파껍질의 항산화 효과(Son 등, 1998), 과일 껍질을 이용한 바이오 에탄올 생산공정 연구(Lee와 Kim, 2014) 등의 연구 결과가 있으며, 향후 폐기되는 농업 부산물의 활용에 관한 연구는 활발하게 진행될 것으로 보인다.

이러한 농업 부산물들은 경제적인 가치와 재활용 가능성이 높을 것으로 평가되지만, 대부분 제대로 활용되지 못하고 폐기되어 경제적인 비용과 환경오염 등의 문제를 유발하고 있어(Kim 등, 2003; Lee 등, 2014; 2018) 농업 부산물을 활용하기 위한 연구가 매우 필요한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 국내 주요 산채류 작물인 더덕의 부위별 주요 영양･기능 성분 함량을 분석하고 항염증 활성을 평가하여 기능성식품 소재 개발을 위한 기초자료로 제공하고자 한다.

재료 및 시약

본 연구에 사용된 2년근 더덕 뿌리 시료는 2022년 2월 강원도 횡성군 소재 농가로부터 구입하여 사용하였다. 모든 시료를 세척한 후 채칼을 사용하여 과육과 껍질을 분리하였으며, 박피 전후와 껍질로 구분하여 각각 세절 후 60°C에서 24시간 열풍건조하였다. 건조된 시료는 분쇄(SMX-6500 JS, Shinil Co., Ltd., Seoul, Korea) 후 30 mesh 체를 통과시켜 균질화한 다음 -20°C에서 저장하면서 사용하였다. Ascorbic acid, tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(TCEP), ethylenediaminetetraacetic acid, metaphosphoric acid(MPA), trifluoroacetic acid(TFA), sodium 1-hexanesulfonate는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 tangshenoside I, lobetyolin 표준품은 Chemfaces(Wuhan, China)에서 구입하였으며, 그 밖의 시약은 analytical 및 HPLC 등급을 사용하였다.

추출물 제조

더덕 뿌리 부위별 건조한 시료 5.00±0.05 g에 70% 에탄올 100 mL를 넣고 30분 동안 초음파 추출(Daihan Scientific, Wonju, Korea)한 후 1,750×g에서 10분간 원심분리(Union 55R, Hanil Science Industry, Gimpo, Korea)하여 상등액을 회수하였다. 위 과정을 3회 반복하여 회수한 상등액을 여과지(Whatman No. 2, Whatman, Tokyo, Japan)로 여과하였다. 그 후 감압농축 및 동결건조하여 항산화 및 항염증 평가용 시료로 사용하였다.

비타민 B₁과 B₃ 분석

더덕 뿌리 부위별 비타민 B₁과 B₃분석을 위해 건조한 시료 1.00±0.05 g을 정확히 칭량하여 0.5 mM sodium 1-hexanesulfonate 용액 50 mL를 가하여 40°C에서 30분간 초음파 추출기(SD-350H, Sungdong Ultrasonic, Seoul, Korea)로 추출하여 방랭하였다. 추출액을 1,750×g에서 10분간 원심분리(Union 55R, Hanil Science Industry)하여 상층액을 취한 후 0.45 μm syringe filter(Whatman, Maidstone, UK)로 여과하여 HPLC 분석용 시료로 사용하였다. HPLC는 Hitachi 5000 Chromaster(Hitachi High-Tech Corporation, Tokyo, Japan)를 이용하였다. Column으로 YMC ODS AM(250×4.6 mm×12 nm, YMC Co., Kyoto, Japan)을 사용하였고 온도는 40°C로 유지하였다. 이동상은 A 용매[0.5 mM sodium 1-hexanesulfonate(acetic acid 7.5 mL+triethylamine 0.2 mL/L)]와 B 용매(MeOH)를 gradient 조건으로 흘려주었고, gradient 조건은 초기 100% A에서 20분간 50% A, 35분까지 50% A 용매, 45분까지 100% A 용매, 55분까지 100% A로 설정하여 분석하였다. 유속은 0.8 mL/min으로 하였고 시료 20 μL를 주입하여 UV detector를 사용하여 270 nm에서 분석하였다(Jin 등, 2021).

비타민 B₂ 분석

더덕 뿌리 부위별 비타민 B₂ 분석을 위해 건조한 시료 1.00±0.05 g을 정확히 칭량하여 증류수 50 mL를 첨가하고 75°C에서 30분간 shaking water bath(HB-205SW, Hanbaek Scientific Co., Bucheon, Korea)로 환류 추출한 후 1,750×g에서 10분간 원심분리(Union 55R, Hanil Science Industry)하였다. 추출물은 0.45 μm syringe filter(Whatman)로 상층액을 여과하여 HPLC 분석용 시료로 사용하였다. HPLC는 Hitachi 5000 Chromaster(Hitachi High-Tech Corporation)를 이용하였다. Column은 YMC-ODS C18 RS Pro(250×4.6 mm, YMC Co.)를 사용하였고 column 온도는 40°C로 유지하였다. 이동상은 A 용매[10 mM NaH2PO4(pH 5.5)]와 B 용매(메탄올)를 75:25(v/v)로 혼합하여 isocratic 조건으로 분석하였다. 유속은 0.65 mL/min으로 하였고 시료 20 μL를 주입하여 fluorescence detector(Ex=445 nm, Em=530 nm)를 사용하여 분석하였다(Jin 등, 2021).

비타민 C 분석

더덕 뿌리 부위별 비타민 C 분석을 위해 건조한 시료 0.50±0.05 g을 정확히 칭량하여 50 mL centrifuge tube에 담아 5 mM TCEP가 포함된 5% MPA 용액 25 mL를 가하고, 12,000 rpm에서 homogenizer(Polytron RT 2500 E, Kinematica AG, Luzern, Switzerland)로 2분간 균질화시켰다. 균질화 후 1,750×g에서 10분간 원심분리(Union 55R, Hanil Science Industry)하여 상등액을 최종 25 mL로 정용하였다. 추출물은 0.2 μm syringe filter(nylon, Whatman, Clifton, NJ, USA)로 여과하여 HPLC 분석용 시료로 사용하였다. HPLC는 Waters 2695(Waters, Milford, MA, USA)를 이용하였다. Column으로 Mightysil RP-18 GP column (4.6×250 mm, 5 μm, Kanto Chemical, Tokyo, Japan)을 사용하였고 온도는 20°C로 유지하였다. 이동상은 0.1% TFA를 0.6 mL/min 속도로 흘려주었고 시료 10 μL를 주입하여 UV detector를 사용하여 254 nm에서 분석하였다(Hwang 등, 2019).

Tangshenoside I과 lobetyolin 분석 방법

더덕 뿌리 부위별 tangshenoside Ⅰ과 lobetyolin 분석을 위해 건조한 시료 1.00±0.05 g을 칭량한 후 50% 에탄올 25 mL를 넣고 실온에서 2회 반복 진탕기(Shaker SK-71, Lab Companion, Daejeon, Korea)로 1시간 추출하였다. 추출액은 1,750×g에서 10분간 원심분리(Union 55R, Hanil Science Industry) 후 여과하여 50 mL로 정용하였다. 추출물은 0.2 μm syringe filter(nylon, Whatman, Clifton, NJ, USA)로 여과한 후 UPLC 분석용 시료로 사용하였다. UPLC는 Waters ACQUITY UPLC system LC(Waters)를 이용하였다. Column은 Kinetex XB-C18(2.1×150 mm, 1.7 μm, Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 사용하였고 column 온도는 40°C로 유지하였다. 이동상은 A 용매(0.1% acetic acid in water)와 B 용매(0.1% acetic acid in acetonitrile)를 gradient 조건으로 흘려주었고, gradient 조건은 3분간 5% B 용매로 유지한 후 17분까지 95% B 용매, 20분까지 95% B 용매, 22분까지 5% B 용매, 25분까지 5% B 용매로 설정하여 분석하였다. 유속은 0.3 mL/min으로 하였고 시료 2 μL를 주입하여 PDA detector를 사용하여 267 nm에서 분석하였다.

Lancemaside A 분석 방법

더덕 뿌리 부위별 lancemaside A 분석을 위해 건조한 시료 1.00±0.01 g에 50% 에탄올 25 mL를 첨가하고 실온에서 2회 반복 진탕기(Shaker SK-71, Lab Companion)로 1시간 추출하였다. 추출액은 1,750×g에서 10분간 원심분리(Union 55R, Hanil Science Industry) 후 여과하여 50 mL로 정용하였다. 추출물은 0.2 μm syringe filter(nylon, Whatman, Clifton, NJ, USA)로 여과한 후 HPLC 분석용 시료로 사용하였다. HPLC는 Agilent 1200 system LC(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하였다. Column은 Kinetex XB-C18(4.6×250 mm, 5 μm, Phenomenex)을 사용하였고, column 온도는 30°C로 유지하였다. 이동상은 A 용매(0.05% trifloroacetic acid in water)와 B 용매(0.05% trifloroacetic acid in acetonitrile)를 gradient 조건으로 흘려주었고, gradient 조건은 3분간 25% B 용매로 유지한 후 10분까지 35% B 용매, 15분까지 35% B 용매, 20분까지 90% B 용매, 30분까지 90% B 용매, 35분까지 25% B 용매, 40분까지 25% B 용매로 설정하여 분석하였다. 유속은 1.0 mL/min으로 하였고 시료 10 μL를 주입하여 PDA detector를 사용해 203 nm에서 분석하였다.

총 폴리페놀 함량 분석

더덕 뿌리 부위별 추출물의 총 폴리페놀 함량 분석은 Kim 등(2021a)의 방법에 따라 측정하였다. 각각의 추출물 100 μL에 2% sodium carbonate 용액 2 mL를 첨가한 후 3분간 상온에서 반응시켰다. 그 후 50% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 100 μL를 혼합하고 30분간 반응시킨 후 UV spectrophotometer(SpectraMax M3 microplate reader, Molecular Devices LLC, San Jose, CA, USA)를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid(GA)를 사용하여 표준 검량선을 작성한 후 총 폴리페놀 함량을 구하였으며, gallic acid equivalent(mg GA eq/g)로 표시하였다.

항산화 활성 측정

더덕 뿌리 부위별 추출물의 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능은 Kim 등(2021a)의 방법에 따라 측정하였다. 100% 메탄올에 DPPH를 용해한 후 2시간 방치하였고 그 후 흡광도 값이 1.0에 가깝도록 희석하여 실험에 사용하였다. 추출물 50 μL와 DPPH 용액 1 mL를 넣고 혼합한 후 암실에서 30분간 반응시켰다. 이 반응액을 UV spectrophotometer를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)] 라디칼 소거능은 Kim 등(2021a)의 방법에 따라 측정하였다. 7 mM ABTS와 2.4 mM potassium persulfate 용액을 혼합하여 24시간 동안 암실에서 반응시켜 ABTS 라디칼을 형성하였고 그 후 흡광도 값이 1.0이 되도록 희석한 후 실험에 사용하였다. 추출물 50 μL와 희석한 ABTS 용액 1 mL를 혼합하여 암실에서 30분간 반응시킨 후 735 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 L-ascorbic acid(AA)를 사용하였고 총항산화력은 L-ascorbic acid equivalent(mg AA eq/100 g)로 나타내었다.

세포 배양

본 실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank; KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. 세포는 10% fatal bovine serum(Gibco, Waltham, MA, USA)과 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle medium(Gibco) 배지를 사용하여 5% CO₂가 공급되는 incubator에서 37°C로 배양하였다.

세포 생존율 측정

RAW 264.7 세포를 96-well plate에 최종 농도 2×10⁵ cells/mL가 되도록 분주한 뒤 24시간 배양하였다. 각각의 더덕 뿌리 부위별 추출물을 처리하고 24시간 배양 또는 각 추출물 처리 1시간 후 1 μg/mL의 lipopolysaccharide(LPS, Sigma-Aldrich)를 처리하여 24시간 배양하였다. 반응 종료 후 세포 생존율 측정을 위해 Ez-Cytox cell viability assay kit(DAEIL Lab, Seoul, Korea)을 사용하였으며, 제조사에서 권장하는 실험 방법에 따라 측정하였다. 무처리 대조군의 흡광도 값을 기준으로 상대적인 세포 생존율을 비교하였다.

Reactive oxygen species(ROS) 측정

RAW 264.7 세포를 96-well black plate에 2×10⁵ cells/mL가 되도록 분주한 뒤 24시간 배양하였다. 각각의 더덕 뿌리 부위별 추출물을 처리하여 미리 1시간 배양하고 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 1시간 배양하였다. 배양 종료 후 phosphate buffered saline(PBS; Gibco)으로 세척하고 10 μM 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA, Sigma-Aldrich) 용액을 처리하여 10분 반응시켰다. 반응 종료 후 PBS로 세척한 세포는 형광현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) 및 fluorescence microplate reader(Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 excitation 510 nm, emission 560 nm에서 형광도를 측정하였다. 무처리 대조군의 형광도 값을 기준으로 상대적인 ROS 생성량을 비교하였다.

미토콘드리아 활성 측정

RAW 264.7 세포를 96-well plate에 2×10⁵ cells/mL가 되도록 분주한 뒤 24시간 배양하였다. 각각의 더덕 뿌리 부위별 추출물을 처리하고 1시간 후 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 24시간 배양하였다. 미토콘드리아 활성을 확인하기 위해 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential, MMP, ΔѰm)의 변화를 TMRE mitochondrial membrane potential assay kit(BioVision, Milpitas, CA, USA)을 사용하여 제조사에서 권장하는 실험 방법에 따라 측정하였다. 반응 종료 후 PBS로 세척하고 100 nM tetramethylrhodamine, ethyl ester(TMRE) 용액을 처리하여 10분 반응시켰다. PBS로 세척한 세포는 형광현미경(Leica Microsystems) 및 fluorescence microplate reader(Tecan)를 이용하여 excitation 510 nm, emission 560 nm에서 형광도를 측정하였다. 무처리 대조군의 형광도 값을 기준으로 상대적인 MMP 값을 비교하였다.

Nitric oxide(NO) 농도 측정

NO 농도 측정은 RAW 264.7 세포를 96-well plate에 2×10⁵ cells/mL가 되도록 분주한 뒤 24시간 배양하였다. 각각의 더덕 뿌리 부위별 추출물을 처리하고 1시간 후 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 24시간 배양하였다. 반응 종료 후 상등액을 수거하여 시료로 사용하였으며, NO 농도 측정은 Griess reagent assay kit(Promega, Madison, WI, USA)을 사용하였으며, 제조사에서 권장하는 실험 방법에 따라 측정하였다. NO는 kit에 포함된 표준용액으로부터 산출된 표준곡선과 비교하였다.

Prostaglandin E2(PGE2) 및 염증성 사이토카인 농도 측정

RAW 264.7 세포를 96-well plate에 2×10⁵ cells/mL가 되도록 분주한 뒤 24시간 배양하였다. 각각의 더덕 뿌리 부위별 추출물을 처리하고 1시간 후 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 24시간 배양하였다. 반응 종료 후 상등액을 수거하여 시료로 사용하였으며, 사이토카인 및 PGE2 농도 측정은 ELISA assay kit(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 제조사에서 권장하는 실험 방법에 따라 측정하였다. 사이토카인 및 PGE2의 농도는 kit에 포함된 표준용액으로부터 산출된 표준곡선과 비교하였다.

단백질 분리 및 western blot 분석

RAW 264.7 세포를 6-well plate에 2×10⁵ cells/mL가 되도록 분주한 뒤 24시간 배양하였다. 각각의 더덕 뿌리 부위별 추출물을 처리하여 미리 1시간 배양하고 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 1시간 또는 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 세척하고 protease inhibitor(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 phosphatase inhibitor(Thermo Fisher Scientific)가 첨가된 RIPA lysis buffer(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 전체 단백질을 분리하였다. 또한 핵 및 세포질 단백질 분리를 위해 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 각각 분리된 단백질은 정량시약(Thermo Fisher Scientific)으로 정량한 다음, sample buffer(Bio-Rad Laboratories)와 혼합하여 sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel(Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 전기영동한 후, polyvinylidene difluoride membrane(Bio-Rad Laboratories)에 전이시켰다. 각각의 membrane은 5% skim milk에서 1시간 처리하여 비특이적인 단백질에 대해 차단했으며, 1차 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 처리하여 overnight 반응시켰다. 세척한 membrane은 적정 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology)로 2시간 반응시킨 후 enhanced chemiluminoesence solution(Bio-Rad Laboratories)에 적용시켜 이미지 장치(Bio-Rad Laboratories)로 특정 단백질의 발현을 분석하였다. 각각의 밴드는 ImageJ^® software(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량하였으며, β-actin과 Lamin B는 internal control로 사용하였다.

NFκB DNA-binding 활성 측정

RAW 264.7 세포를 6-well plate에 2×10⁵ cells/mL가 되도록 분주한 뒤 24시간 배양하였다. 각 추출물을 처리하여 1시간 전배양 후 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 1시간 배양하였다. 핵단백질을 분리하기 위해 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 분리된 핵단백질은 정량시약(Thermo Fisher Scientific)으로 정량한 다음, 활성 평가를 위한 시료로 사용하였다. NFκB DNA-binding 활성은 NFκB p65 transcription factor assay kit(Abcam, Cambridge, UK)을 사용하였으며, 제조사에서 권장하는 실험 방법에 따라 측정하였다. 무처리 대조군의 흡광도 값을 기준으로 상대적인 NFκB DNA-binding 활성을 비교하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 반복 실시하였으며 통계분석은 SPSS 통계프로그램(Statistical Package for the Social Science, Ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하였다. 각 측정군의 평균과 표준편차를 산출하고 그룹 간의 차이는 one-way ANOVA test와 Student’s t-test를 사용하여 P<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.

비타민 B 복합체(B₁, B₂, B₃)와 비타민 C 함량

비타민은 인체조직의 유지와 성장, 일반적인 대사에 필요한 유기화합물로, 체내에서 생합성되지 않기 때문에 외부로부터 섭취해야 하는 필수영양소이다. 비타민 B 복합체는 당질대사에 관여하는 비타민 B₁(티아민), 에너지 생성 및 지질대사에 관여하는 비타민 B₂(리보플라빈) 그리고 혈액순환과 콜레스테롤 감소 효과 등의 기능성을 나타내는 비타민 B₃(니아신)가 있다(Cho 등, 2020). 특히 비타민 C는 인체 내 콜라겐 합성, 항산화 작용, 면역 기능 향상 등 다양한 인체 내 반응에 참여한다(Hwang 등, 2014). 더덕 뿌리의 전체, 과육 및 껍질 부위의 비타민 B₁ 함량을 분석한 결과 각각 0.086, 0.115, 0.054 mg/100 g fresh weight(FW)로 과육 부위가 유의적으로(P<0.05) 가장 높은 함량을 나타내었다(Table 1). 더덕 뿌리의 부위별 비타민 B₂와 B₃ 함량을 분석한 결과 껍질 부위가 각각 0.180 및 0.235 mg/100 g FW 함량 수준으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 비타민 C 함량의 경우 더덕 뿌리 과육 부위가 6.256 mg/100 g FW로 유의적으로(P<0.05) 높았고, 껍질 부위는 5.670 mg/100 g FW로 나타났다. RDA(2016)에 따르면 더덕 뿌리의 B₁, B₂, B₃와 C 함량은 각각 0.036, 0.171, 0.014 및 5.31 mg/100 g FW로 본 연구 결과와 큰 차이를 보이지 않았다. 도라지 뿌리와 비교했을 때, B₁, B₂, B₃와 C 함량은 각각 0.007, 0.065, 0.571 및 5.06 mg/100 g FW로 더덕 뿌리보다 B₁과 B₂ 함량은 낮고 B₃ 함량은 높았으며, C 함량은 유사한 것으로 나타났다.

Table 1 . Content of vitamin B1, B2, B3, and C in deodeok (mg/100 g, FW).

	Whole	Flesh	Peel
Vitamin B1	0.086±0.003b	0.115±0.002a	0.054±0.002c
Vitamin B2	0.096±0.000b	0.064±0.000c	0.180±0.001a
Vitamin B3	0.162±0.003b	0.062±0.001c	0.235±0.003a
Vitamin C	5.287±0.127b	6.256±0.202a	5.670±0.185b

Values are the mean±SD of three replications (n=3). Different small letters in the same row indicate significant differences (P<0.05) by Duncan’s multiple range test. All values presented in table are on fresh weight. FW: fresh weight..

Tangshenoside I, lobetyolin, lancemaside A 함량 분석

Tangshenoside I, lobetyolin과 lancemaside A 성분은 더덕 뿌리의 주요 기능 성분이며 특히 lancemaside A는 Codonopsis 속에 특이적으로 존재하는 사포닌으로 주목받고 있다(Ichikawa 등, 2009; Hossen 등, 2016; An 등, 2021). 또한 대부분의 Codonopsis(초롱꽃과) 식물들에서 tangshenoside I과 lobetyolin이 검출된다고 명시되어 있으며 같은 Codonopsis인 당삼의 지표성분으로 선정되어 있다고 보고되어 있다(MFDS, 2022). 더덕 뿌리 전체, 과육 및 껍질 부위의 tangshenoside I 함량은 각각 39.11, 24.66 및 64.37 mg/100 g FW로 나타났고, 껍질 부위가 유의적으로(P<0.05) 가장 높은 함량을 보였다(Fig. 1). Lobetyolin 함량도 껍질 부위가 26.65 mg/100 g FW로 유의적으로(P<0.05) 가장 높은 것으로 나타났다(Fig. 1). Triterpene saponin 계열인 lancemaside A 함량은 더덕 뿌리 전체, 과육 및 껍질 부위에서 각각 101.73, 70.22 및 135.38 mg/ 100 g FW로 껍질 부위의 함량이 유의적으로(P<0.05) 높았다(Fig. 1). Lancemaside A는 더덕에 특이적으로 존재하는 사포닌 성분으로 항산화, IKK/NF-κB 저해 활성과 myeloperoxidase activity를 통한 항염, acetylcholinesterase 저해 활성 통한 항알츠하이머 활성 등 다양한 기능이 밝혀져 있다. 더덕 뿌리의 껍질 부위는 특이적 성분인 lancemaside A가 과육 부위보다 높게 함유되어 있어 농산 부산물의 활용 수준을 넘어선 새로운 기능성 소재로서 응용이 가능할 것으로 보인다. Li 등(2014), da Silva 등(2014), Fischer 등(2011)에 따르면 과일류에 함유된 폴리페놀 같은 기능 성분이 과육보다 껍질에 높게 함유된 이유는 UV와 산화로부터 과일을 보호하기 위해서임을 밝혔다. 더덕 뿌리 또한 다양한 외부 스트레스로부터 뿌리 과육을 보호하기 위해 껍질에서 2차 대사산물이 비교적 높게 함유되는 것으로 추정할 수 있었다.

Fig 1. Lancemaside A (A), tangshenoside I (B), lobetyolin (C), and total polyphenol (D) contents in whole, flesh, and peels of deodeok. Value are shown as mean±SD of triplicate. Different small letters on the bars indicate a significant difference at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

폴리페놀 함량 및 항산화 활성

폴리페놀성 화합물이란 두 개 이상의 수산기를 가지는 방향족 화합물을 뜻하며, 수산기를 통한 수소 공여와 페놀 공명 구조의 안정화에 의해 항산화를 비롯한 다양한 생리활성을 보유한다고 알려져 있다(Choi 등, 2019). 더덕 뿌리의 전체, 과육 및 껍질 부위의 총 폴리페놀 함량을 분석한 결과는 Fig. 1D와 같이 껍질, 전체, 과육 부위 순으로 총 폴리페놀 함량이 유의적으로(P<0.05) 높았다. Kang(2009)은 더덕 과육과 껍질로부터 세포벽 물질을 얻어 페놀성 화합물을 분석하였고 vanillic acid, ferulic acid 등의 페놀 화합물 함량 차를 비교하였다. 그 결과 vanillic acid의 경우 더덕 껍질이 과육에 비해 약 5배 높았으며, ferulic acid는 더덕 껍질에서 과육보다 약 6배 높은 함량이 있음을 확인하였다.

더덕 뿌리 부위별 항산화 활성을 평가하고자 ABTS 양이온 라디칼, 소거능은 각각 17.04, 13.66 및 19.31 mg AA eq/100 g FW로 더덕 껍질 부위의 항산화 활성이 유의적으로(P<0.05) 가장 높은 것으로 확인되었다(Fig. 2B). Ryu 등(1997)은 폴리페놀의 함량과 항산화 활성이 높은 양의 상관관계를 가지기 때문에, 이들로 인해 높은 항산화 활성이 나타날 수 있다고 보고한 바 있다. 선행연구에 따르면 더덕의 glutathione reductase 활성을 측정한 결과 더덕 과육에서 나타나지 않았던 활성이 껍질에서 유의적으로 높게 나타났다고 보고하였다(Won과 Oh, 2007). 이는 본 연구와 동일한 결과로, 더덕의 뿌리 과육 부위뿐 아니라 껍질 부위에도 항산화 성분이 높게 함유되어 있음을 짐작할 수 있다. Guo 등(2003)은 28가지 과일의 부위별 항산화 활성을 측정한 결과 껍질이 과육보다 2~27배 높은 항산화 활성을 나타낸다는 사실을 보고하였으며, 원인 가설을 부위별 수분 함량이라고 밝혔다. 시료들의 수분 함량을 측정한 결과, 껍질이 과육보다 약 10% 낮았고 이는 껍질에 풍부한 항산화 물질이 공급되었을 수 있다고 예상한 것이다. 과·채소류 껍질 부위의 높은 기능 성분 및 기능성에 관한 원인은 여러 가지가 복합적으로 나타난 것으로 생각되며, 폐기되는 농산 부산물의 다양한 기능성 평가가 이루어진다면 더덕 껍질을 활용한 기능성식품 소재 개발이 가능할 것으로 생각된다.

Fig 2. ABTS (A) and DPPH (B) radical scavenging activity in whole, flesh, and peels of deodeok. Value are shown as mean±SD of triplicate. Different small letters on the bars indicate a significant difference at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

RAW 264.7 세포의 증식에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 더덕 부위별 추출물의 항염증 활성을 검증하기 위한 조건을 설정하기 위해 RAW 264.7 세포의 증식에 미치는 더덕 부위별(전체, 과육, 껍질) 추출물의 영향을 확인하였다. 이를 위하여 다양한 농도(0~200 μg/mL)의 더덕 부위별 추출물이 처리된 조건에서 24시간 동안 반응한 RAW 264.7 세포 생존율을 평가하였다(Fig. 3A). 그 결과, 무처리군의 세포 생존율 100%와 비교했을 때 대조군과 더덕 추출물을 처리한 경우 200 μg/mL 농도까지 대조군과 유사한 수준으로 생존율이 유지되었다. 또한 선행연구에서 RAW 264.7 세포의 생존에 유의적인 영향을 미치지 않은 1 μg/mL의 LPS를 염증성 및 산화적 스트레스 유발 조건으로 설정하였으며(Kim 등, 2021d), 200 μg/mL의 더덕 추출물이 존재하는 조건에서 1 μg/mL의 LPS가 처리된 세포에서도 대조군과 비교하여 유의적인 세포 생존율의 감소는 관찰되지 않았다(Fig. 3B). 이에 더덕 추출물의 항염증 활성을 평가하기 위해 양성 대조군인 LPS의 농도는 1 μg/mL로, 더덕 부위별 추출물의 최고 농도는 200 μg/mL로 선정하였다.

Fig 3. Effect of CRE on viability of RAW 264.7 cells. (A) RAW 264.7 cells were treated with the indicated concentrations of CRE alone for 24 h or (B) pre-treated with CRE for 1 h before of LPS (1 μg/mL) stimulation for 24 h, then the cell viability was assessed by EZ-cytox cell viability assay. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. CRE: Codonopsis lanceolata roots extracts.

RAW 264.7 세포에서 LPS에 의한 ROS 생성에 미치는 영향

ROS의 과잉 생산으로 정의되는 산화적 스트레스는 염증을 포함한 다양한 인체 병리학적 상태와 밀접하게 관련이 있다(Brüne 등, 2013). 과도하게 생성된 ROS는 염증반응의 신호전달계와 연결되어 세포막, 지질, 핵산 및 단백질을 포함한 세포 구조물을 손상시키고 조직에 비가역적인 변화를 유도하여 노화뿐만 아니라 암, 치매, 당뇨 등의 다양한 질환을 일으킨다고 알려져 있다(Knowles와 Moncada, 1994; Tan 등, 2016). 이에 더덕 부위별 추출물이 LPS에 의해 유도되는 ROS의 생성을 줄일 수 있는지 DCF-DA 염색을 통하여 평가하였다. 그 결과 RAW 264.7 세포에서 LPS 단독 처리군은 무처리 대조군과 비교하여 2배 이상으로 ROS 생성이 증가하였고, 모든 더덕 추출물은 농도 의존적으로 ROS 생성을 억제하였다(Fig. 4A). 200 μg/mL의 농도에서 무처리군 대비 ROS 함량은 더덕 뿌리 전체 추출물이 135%, 과육 추출물이 172% 그리고 껍질 추출물이 117%로 LPS에 의해 유도되는 ROS 생성을 감소시켰으며, 껍질 부위 추출물의 ROS 소거 활성이 가장 크게 확인되었다. 형광현미경으로 확인한 결과에서도 ROS 생성을 의미하는 초록 형광의 강도가 LPS 단독 처리군에서는 무처리 대조군과 비교하여 강하게 나타났으나 더덕 추출물을 200 μg/mL의 농도로 전처리하였을 때 형광 강도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4B). 다양한 연구에서 기능성 소재를 처리했을 때, LPS로 유도된 ROS를 소거함으로써 RAW 264.7 세포의 손상을 억제할 수 있다고 보고하였다(Picca 등, 2021; Ren 등, 2020). 본 연구에서 더덕 추출물의 전처리가 RAW 264.7 세포에서 LPS 처리에 의한 ROS 발생을 감소시켰으며, 염증반응 억제에 도움이 될 것으로 판단된다.

Fig 4. Inhibition of ROS generation by CRE in LPS-treated RAW 264.7 cells. Cells were pre-treated with CRE for 1 h and then treated with LPS (1 μg/mL) for 1 h. After staining with DCF-DA florescent dye, (A) DCF fluorescence intensity was measured using a fluorescence microplate reader. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.05 compared with the control (None) group, *P<0.05 compared with the LPS treated group. (B) The fluorescent images were obtained by a fluorescence microscope (magnification 200×, scale bar 20 μm). These images are repersentative of at least three independent experiments.

RAW 264.7 세포에서 LPS에 의한 미토콘드리아 활성 저하에 미치는 영향

미토콘드리아는 ROS 생성을 담당하는 주요 세포 내 소기관이며 염증성 반응과 연관된 산화적 스트레스에 취약하다(Dunn 등, 2015). 산화적 스트레스로 인해 미토콘드리아 막 전위가 감소하거나 파괴되어 염증을 유발하고 세포를 죽음에 이르게 한다(Hulsmans 등, 2012; Lee와 Yang, 2012). 따라서 더덕 부위별 추출물에 의한 ROS 생성 억제가 미토콘드리아의 활성과 관련 있는지 조사하기 위해 TMRE 염색을 실시하였다. 양이온을 가지며 소수성인 TMRE 염료는 음이온을 띠는 미토콘드리아 내로 이동하여 막전위에 의존적인 붉은색의 형광을 나타내게 된다(Ehrenberg 등, 1988). 그 결과 RAW 264.7 세포에서 LPS 단독 처리군은 무처리 대조군과 비교하여 64.4%로 MMP가 감소하였고, 모든 더덕 부위별 추출물은 농도 의존적으로 MMP를 증가시켰다(Fig. 5A). 특히 200 μg/mL의 농도에서 더덕 뿌리 전체 추출물은 82%, 과육 추출물은 79% 그리고 껍질 추출물은 89%로 MMP를 증가시켰으며, 껍질 추출물의 MMP 회복이 가장 크게 확인되었다. 형광현미경으로 확인한 결과에서도 MMP 수준을 의미하는 붉은 형광의 강도가 LPS 단독 처리군에서는 무처리 대조군과 비교하여 현저하게 감소하였으나 더덕 추출물을 200 μg/mL의 농도로 전처리하였을 때 형광 강도가 증가한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5B). 이는 더덕 추출물이 RAW 264.7 세포에서 LPS 유도된 산화적 스트레스를 효율적으로 억제하고, LPS에 의해 감소한 MMP를 회복시켰다고 할 수 있다.

Fig 5. Increase fo MMP level by CRE in LPS-treated RAW 264.7 cells. Cells were pre-treated with CRE for 1 h and then treated with LPS (1 μg/mL) for 24 h. After staining with TMRE florescent dye, (A) TMRE fluorescence intensity was measured using a fluorescence microplate reader. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.05 compared with the control (None) group, *P<0.05 compared with the LPS treated group. (B) The fluorescent images were obtained by a fluorescence microscope (magnification 200×, scale bar 20 μm). These images are repersentative of at least three independent experiments.

RAW 264.7 세포에서 LPS에 의한 염증반응에 미치는 영향

LPS에 의한 활성화는 대식세포의 세포 표면에 발현하는 toll-like receptor4(TLR4)를 통해 유도되며 다양한 신호 전달 경로를 활성화시켜 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-6(IL-6) 및 interleukin-1 beta(IL-1β)를 비롯한 염증성 사이토카인의 생성을 증가시킨다. 또한 inducible nitric oxide synthase(iNOS) 및 cyclooxygenase-2(COX-2)의 발현을 유도함으로써 NO와 PGE2와 같은 염증 매개 물질의 생성을 증가시킨다(Lee 등, 2017; Johnson 등, 2002; Yoon 등, 2009). 따라서 기능성 물질에 의한 대식세포 내 염증성 사이토카인 및 염증 매개 물질의 생성 억제는 항염증 활성 평가의 지표로 활용될 수 있다. 본 연구에서는 LPS 단독 처리군은 무처리 대조군과 비교하여 NO뿐만 아니라 PGE2의 생성이 크게 증가하였다(Fig. 6A, B). 또한 LPS 처리로 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성이 증가하였다(Fig. 7). 그러나 더덕 추출물의 처리로 NO, PGE2 및 염증성 사이토카인이 감소하였으며, 활성의 크기는 더덕 뿌리껍질, 전체, 과육 순이었다. 또한 NO, PGE2 생성의 중요한 역할을 담당하는 효소인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현을 확인한 결과, LPS 단독 처리군은 무처리 대조군과 비교하여 iNOS와 COX-2의 발현이 증가하였고, 200 μg/mL 더덕 추출물의 처리로 발현이 억제되었다(Fig. 6C). iNOS와 COX-2의 발현 평가에서도 더덕 뿌리껍질 추출물의 활성이 가장 큰 것으로 확인되었다. 따라서 더덕 추출물에 의한 NO, PGE2 및 염증성 사이토카인의 생성 억제는 관련 유전자의 발현 차단에 의한 것이며, 이러한 더덕 추출물의 항염증 잠재력이 LPS로 인해 유발된 산화적 스트레스의 효율적 억제 활성과 관련 있음을 시사한다.

Fig 6. Inhibitory effects of CRE on the production of NO and PGE2, as well as the protein expression of iNOS and COX2, in LPS-LPS-treated RAW 264.7 cells. Cells were pre-treated with CRE for 1 h and then treated with LPS (1 μg/mL) for 24 h. (A) The concentration of NO in the culture medium was detected by the Griess reaction. (B) The concentration of PGE2 in the culture medium was measured by ELISA kit. (C) Total cell lysates were prepared and the levels of the proteins were evaluated by western blot analysis. β-Actin was used as a control. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.05 compared with the control (None) group, *P<0.05 compared with the LPS treated group.

Fig 7. Inhibitory effects of CRE on the production of pro-inflammatory cytokines in LPS-LPS-treated RAW 264.7 cells. Cells were pre-treated with CRE for 1 h and then treated with LPS (1 μg/mL) for 24 h. The concentration of cytokine in the culture medium, including TNF-α (A), IL-6 (B), and IL-1β (C), were measured by ELISA kits. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. ^#P<0.05 compared with the control (None) group, *P<0.05 compared with the LPS treated group.

RAW 264.7 세포에서 LPS에 의한 염증반응 신호전달계 활성에 미치는 영향

염증 전사인자 중 하나인 nuclear factor-kappa B(NF-κB)는 염증반응과 면역반응에 관여하며 종양형성, 자가면역, 염증 질환 유전자 발현을 조절한다(Schottelius와 Baldwin, 1999; Karin, 2006). 세포질에서 p65 및 p50 subunit의 이량체로 이루어진 NF-κB는 내인성 억제제인 inhibitor kappa B alpha(IκBα)와 복합체를 형성하고 있지만, 산화적 스트레스를 비롯한 다양한 자극으로 인해 IκBα가 빠르게 인산화되면서 해리된 NF-κB는 핵으로 이동하여 염증 관련 유전자의 전사 활동을 유도한다(Finco와 Baldwin, 1995; Klement 등, 1996). Extracellular signal-regylated kinase(ERK), c-Jun N-terminal kinase(JNK) 및 p38 kinase를 포함한 mitogen-activated protein kinase(MAPK)는 정상적인 세포의 분열 및 증식, 분화조절 등에 관여하고 단백질 인산화에 의해 부분적으로 제어되는 특징을 가진다(Yang 등, 2018). MAPK 경로의 활성화는 NF-κB와 같은 전사조절인자의 발현 조절을 통해 NO와 다양한 염증 매개 물질의 생성을 촉진하며, ROS에 매우 민감하게 반응한다(Lai 등, 2017; Liu 등, 2012). 따라서 산화적 스트레스와 함께 NF-κB 및 MAPK의 활성을 효율적으로 조절함으로써 염증성 매개 물질의 분비를 감소시킬 수 있는 물질은 다양한 염증성 질환 치료에 유망한 후보가 될 수 있다. 본 연구에서는 더덕 추출물의 항염증 기전 연구를 위해 LPS로 인한 NF-κB 및 MAPK의 활성에 미치는 더덕 추출물의 영향을 평가하였다. NF-κB의 활성 정도를 측정하기 위해 DNA-binding activity를 측정한 결과, LPS 단독 처리군의 NF-κB DNA-binding 활성은 무처리 대조군과 비교하여 2.6배 이상으로 증가하였다. 그러나 200 μg/mL의 농도에서 더덕 뿌리 전체 추출물은 210%, 과육 추출물은 250% 그리고 껍질 추출물은 187%로 NF-κB DNA-binding 활성을 감소시켰으며, 껍질 추출물의 활성이 가장 크게 확인되었다(Fig. 8A). 단백질 발현으로 NF-κB의 활성을 평가했을 때(Fig. 8B, C), LPS가 처리된 세포에서 NF-κB p65의 발현은 세포질에서 현저히 감소한 반면, 핵에서의 발현은 크게 증가하였다. 또한 세포질에서 IκBα의 발현은 감소하여 LPS 자극에 의해 NF-κB가 핵으로 전이되었음을 알 수 있었다. 그러나 더덕 추출물의 처리로 NF-κB 활성은 감소하였으며, 활성의 크기는 껍질, 전체, 과육 순이었다. 그리고 MAPK의 활성을 평가했을 때(Fig. 8D), 더덕 추출물 중 과육 추출물과 전체 추출물은 LPS 처리로 인해 증가한 p38의 인산화를 저해하지 못했지만 ERK, JNK의 인산화 수준을 감소시켰다. 껍질 추출물은 ERK, JNK, p38의 인산화 수준을 모두 감소시켰으며, 이는 상기 결과들의 활성 크기 비교에서 껍질 추출물이 다른 시료의 추출물보다 우수한 활성을 나타낸 것과 일치하였다. 다양한 연구에서 더덕 추출물의 항산화 및 항염증 활성이 밝혀졌으며, 이는 tangshenoside, lobetyolin, lancemaside 등과 같은

Fig 8. Effect of CRE on the expression of members of NF-κB and MAPK signaling pathways in LPS-LPS-treated RAW 264.7 cells. Cells were pre-treated with CRE for 1 h and then treated with LPS (1 μg/mL) for 1 h (A-C) or 24 h (D). (A) NF-κB binding activity in the nuclear protein extracts was measured by ELISA kit. Data are presented as the mean±SD of three independent experiments. #P<0.05 compared with the control (None) group, *P<0.05 compared with the LPS treated group. (B and C) Cytoplasmic and nuclear proteins were isolated and determined the expression of NF-κB and IκBα. Actin and Lamin B were used as a control for cytosolic and nuclear. (D) Total cell lysates were prepared and the levels of the proteins were evaluated by western blot analysis. Actin was used as a control.

기능 성분과 관련한다고 알려져 있다(Kim 등, 2014; 2019; Lee 등, 2019). 이 중 주요 사포닌인 lancemaside A는 세포 수준에서 NF-κB 및 MAPK 활성 억제를 통해 염증 매개 인자의 생성을 감소시킴으로써 항염증 활성을 나타낸다고 보고하였다(Jeong 등, 2013; Kim 등, 2014). Joh 등(2010)은 lancemaside A가 대장염 동물모델에서 NF-κB 활성 억제를 통해 염증을 개선할 수 있다고 하였다. 본 연구에서 더덕 추출물, 특히 기능 성분 함량이 높았던 껍질을 포함하는 추출물이 NF-κB 활성 및 MAPK 신호전달 경로를 효과적으로 억제함으로써 iNOS와 COX-2의 발현, NO 및 염증성 사이토카인의 생성을 감소시킨 것(Fig. 9)은 lancemaside A를 포함한 기능 성분과 관련 있을 것으로 판단된다.

Fig 9. Proposed mechanism for CRE-mediated regulation of inflammation in LPS-treated RAW 264.7 cells. LPS increases ROS generation in the mitochondria, and activates NF-κB and MAPK signaling pathways, resulting in the production of NO, PGE2 and pro-inflammatory cytokines. CRE attenuats ROS production, and suppresses NF-κB and MAPK signaling pathways, leading to diminished inflammation.

본 연구에서는 더덕 뿌리의 전체, 과육, 껍질 부위에 함유된 총 폴리페놀 함량, 비타민 B 복합체, 비타민 C, lancemaside A, tangshenoside I, lobetyolin 함량을 분석하여 더덕 부위에 따른 생리활성물질 함량을 비교하였다. 또한 항산화 및 항염증 활성을 측정하고자 하였다. 본 연구 결과 더덕 뿌리 부위 중 껍질 부위의 총 폴리페놀 함량과 비타민 B 복합체와 비타민 C의 함량이 유의적으로(P<0.05) 높음을 확인하였다. Lancemaside A는 더덕 뿌리 과육보다 껍질에서 약 2배 높은 함량을 보였으며 tangshenoside I과 lobetyolin의 함량 또한 과육보다 껍질에서 약 3배 높은 함량을 나타냈다. 더덕 뿌리 부위별 추출물은 LPS가 처리된 대식세포에서 ROS 생성 및 미토콘드리아 기능 소실을 억제하였으며, NF-κB와 MAPK 활성을 차단함으로써 염증 매개 인자 및 염증성 사이토카인의 생성을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다. 특히, 더덕 뿌리의 껍질 부위가 전체 및 과육보다 우수한 항염증 활성을 나타냈으며, 이는 lancemaside A를 포함한 기능 성분의 함량과 밀접한 관련이 있을 것으로 판단된다. 본 연구 결과를 토대로 더덕의 부산물로 여겨지는 껍질 부위의 기능성식품 소재로서 가능성을 확인할 수 있었다.

본 성과물은 농촌진흥청 연구사업(과제번호: PJ01670604)의 지원에 의해 이루어진 것임.