건강 기능성 식품으로 가장 각광을 받는 홍삼은 인삼을 증숙 가공하여 인삼의 저장성을 높임과 동시에 인삼이 가지고 있는 사포닌 구조를 변환시켜 기능성을 높인 인삼 가공품이다. 수삼을 그대로 건조하여 만든 백삼에 비하여 ginsenoside-Rg3 등과 같은 특정 사포닌이 홍삼에 함유되어 있어서, 가공되지 않은 상태의 인삼이 가지고 있는 ginsenoside Rb1과 Rg1의 사포닌 성분과 함께 기능성 식품 지표성분으로 인증받고 있다(MFDS, 2015; 2017). 인삼의 기능성은 면역력 증진, 피로회복, 뼈 건강에 도움을 줄 수 있는 기능을, 홍삼은 인삼의 기능성인 면역력 증진 및 피로 개선 이외에 혈소판 응집억제를 통한 혈액 흐름 개선, 기억력 개선 항산화 작용 및 갱년기 여성의 건강에 도움을 줄 수 있는 것으로 인삼을 홍삼으로 제조함으로써 기능성이 향상됨을 볼 수 있다. 현재까지 연구를 통해 인삼의 약리적 효능으로 항상성 유지 효과(Brekhman과 Dardymov 등, 1969; Nocerino 등, 2000), 항스트레스 및 항산화 활성(Gillis, 1997; Attele 등, 1999), 항피로(Kim, 2009; Wang 등, 1983), 면역기능 강화(Singh 등, 1984; Kenarova 등, 1990), 항동맥경화(Wang 등, 2000), 항당뇨(Yoshikawa 등, 2003), 항암활성(Mochizuki 등, 1995; Wakabayashi 등, 1998; Ahuja 등, 2018), 간 기능 항진(Wu 등, 1992; Lee 등, 2005a), 항염증(Park, 2004; Hyun 등, 2009) 등의 수많은 연구가 보고되었다(Nam, 2005). 이와 같이 홍삼은 열처리로 인삼이 가지고 있는 본래의 유용성분 이외의 성분들이 신생 되고(Choi 등, 2010), 가공되지 않은 인삼 특성보다 더 나은 여러 가지 기능성을 보인다고 한다(Nam, 2005). 그중에 대표적인 것이 항산화 활성이라고 볼 수 있는데, 이는 홍삼 제조과정을 통해 비사포닌계 생리활성물질로 암세포 증식억제 활성을 가진 panaxytriol 등이 생성되고, 또 Maillard 반응 생성물로 항산화 활성 성분인 maltol, 당 및 아미노산이 결합된 arginyl-fructosyl-glucose 등이 생성된다는 것이 발견되어 홍삼의 항산화 활성이 높아지는 것을 보고하고 있다(Lee 등, 2005b; Nam, 2005; Kim 등, 2010; Jang 등, 2016). Jang 등(2016)은 인삼을 백삼, 홍삼 및 흑삼으로 제조한 것을 추출하여 생리활성을 비교한 결과, 증숙과 건조과정이 여러 번 반복된 흑삼에서 DPPH 및 ABTS 전자소거능 등이 백삼이나 홍삼보다 높았으며 ROS 생성량은 적게 생성되는 것으로 보아 증숙과 건조과정이 항산화 활성에 영향을 끼친다고 하였다. 또 Jung 등(2012)은 홍삼을 고온 고압 처리하였을 때 페놀산 함량과 항산화 활성이 높아졌다고 보고한 것 등을 고려해보면 홍삼도 제조과정에 따라 차이가 남을 볼 수 있었다. 백삼이나 홍삼에 구기자를 혼합 추출하여 항산화 활성을 향상시킬 수 있었다고 보고된 바 있다(Seong 등, 2018). 또한 Kim 등(2012)이 자생식물과 생약 자원 40점에 대한 추출물의 폴리페놀, 플라보노이드 함량 및 항산화 활성을 탐색한 것과 Kim 등(2014)이 국내 자생식물 458점의 추출물로 DPPH 전자소거능을 본 것 등을 고려하면 홍삼보다 천연자원 중에 폴리페놀성 물질을 더 많이 함유하고 있고 항산화 활성도 높은 소재들이 있음을 알 수 있다. 이상과 같이 본 연구에서는 국화과 식물이 폴리페놀성 물질의 함량도 높고 항산화 활성 및 항염 활성이 높았다고 보고한 연구(Nam과 Yang, 1995; Jang 등, 1999; Shin과 Choi, 1982; Kim, 2003)를 참고하여 국화 추출물을 이용해 항산화 효과를 검증하고, 홍삼농축액과 국화 추출물의 복합물로 항산화 활성을 향상시킨 제품을 제조하기 위해 가장 적절한 혼합비를 구하고 이에 대한 항산화 활성을 검증하여 새로운 제품 개발에 관한 기술 레시피를 확립하고자 하였다.

실험재료

본 연구에서 사용한 국화(菊花, Chrysanthemum morifolium Ramatue)의 노란색 국화꽃(Chrysanthmi Flos, CF)은 경북 영천에서 2020년도에 재배된 것을 10월 중하순에 채취하여 생산된 제품(제품명: 휴먼 국화, Humanherb, Daegu, Korea)을 구입하였고, 기원을 확인하기 위하여 중부대학교 관련학과 본초학 연구실험실에서 기원을 확인 검증하였다. 시료는 가용 부위만 골라 50°C의 온도에서 재건조한 후 2±1°C에서 냉장 보관하면서 추출 시료로 사용하였다. 추출은 20배의 물로 80°C의 온도에서 8시간 추출하여 3°Brix의 농도로 만든 추출액을 재료로 사용하였다. 홍삼농축액(RGCON)은 충남 논산에서 생산된 제품(제품명: Korean red ginseng extract 마이스터 홍삼농축액, Rg₁+Rb₁+Gg₃의 합 10 mg/g, 70°Brix, NOLMAE INSAM Co., Ltd., Nonsan, Korea)을 구입하여 사용하였고, 꿀(아카시아꿀, Dongsuh Foods Co., Jincheon, Korea)을 혼합비에 첨가하는 재료로 사용하였다.

실험 디자인 및 홍삼 스틱 제품 제조

국화 추출액, 홍삼농축액 및 꿀의 최적 배합비를 도출해내기 위하여 Minitab 17(Minitab Inc., State College, PA, USA) 프로그램으로 반응표면 실험계획법(response surface methodology)의 중심합성계획법에 따라 실시하였다. 독립변수로는 홍삼농축액(RGCON, X₁), 국화 추출액(CFEX, X₂) 및 꿀(Honey, X₃)의 함량을 3개의 요인으로 설정하였고, 세 가지 변수를 -2, -1, 0, 1, 2의 5단계로 부호화하였다. 종속변수로는 혼합액의 농도(°Brix)와 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 함량 및 진세노사이드 함량 등의 유효성분과 항산화 활성 측정 방법인 DPPH 전자 소거 활성, ABTS 양이온 소거 활성, hydroxyl 라디칼 소거 활성 및 Fe²⁺(ferrous ion) chelating 활성에 의한 항산화 효과를 설정하였다. RGCON(X₁), CFEX(X₂) 및 Honey(X₃)의 적정 배합 비율을 설정하기 위해 예비실험을 하여 국화 추출물을 혼합한 홍삼농축액 이용 스틱 제품의 배합 비율의 한계 구간을 결정시켜 표준화시켰다(Table 1). 국화 추출물을 첨가한 홍삼농축액은 Table 1과 같은 재료 및 혼합조건으로 혼합한 다음 살균 처리하여 스틱형 포장지에 15 g씩 주입하여 봉입한 후 상온에서 1개월간 숙성한 것을 실험의 시료로 이용하였다.

Table 1 . Experimental design for red ginseng concentrated stick products with Chrysanthmi Flos (CF) extract and honey.

Sample No.	Run order	Variables1)			Water (g)
		X1 (RGCON, g)	X2 (CFEX, g)	X3 (Honey, g)
1	13	−1(9)	−1(5)	−1(0.5)	15.0
2	8	+1(11)	−1(5)	−1(0.5)	15.0
3	7	−1(9)	+1(15)	−1(0.5)	15.0
4	14	+1(11)	+1(15)	−1(0.5)	15.0
5	4	−1(9)	−1(5)	+1(1.5)	15.0
6	6	+1(11)	−1(5)	+1(1.5)	15.0
7	3	−1(9)	+1(15)	+1(1.5)	15.0
8	2	+1(11)	+1(15)	+1(1.5)	15.0
9	19	−2(8)	0(10)	0(1.0)	15.0
10	11	+2(12)	0(10)	0(1.0)	15.0
11	12	0(10)	−2(0)	0(1.0)	15.0
12	18	0(10)	+2(20)	0(1.0)	15.0
13	20	0(10)	0(10)	−2(0)	15.0
14	17	0(10)	0(10)	+2(2.0)	15.0
15	16	0(10)	0(10)	0(1.0)	15.0
16	10	0(10)	0(10)	0(1.0)	15.0
17	15	0(10)	0(10)	0(1.0)	15.0
18	9	0(10)	0(10)	0(1.0)	15.0
19	1	0(10)	0(10)	0(1.0)	15.0
20	5	0(10)	0(10)	0(1.0)	15.0

¹⁾X₁: red ginseng concentrate (RGCON, 70°Brix), X₂: extract of CF (CFEX, 3°Brix)..

총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량

총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량 분석에 대한 시료는 RGCON(70°Brix), CFEX(3°Brix), 꿀 및 물로 디자인된 혼합 처리구의 시료액을 각각 20배 희석한 액으로 분석하여 정량하였다. 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법(1912)을 응용하여 분석하였다. 시료액을 각각 20배 희석한 액 500 µL에 0.1 N Folin-Ciocalteau 500 µL를 혼합한 후 상온에서 5분간 반응시킨 혼합물에 1 M sodium carbonate(Na2CO3) 용액 500 µL를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고 spectrophotometer(X-ma 1200, Human Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 765 nm에서 측정하였다. 표준물질은 gallic acid를 25, 50, 100 및 250 μg/mL의 농도로 조제한 후 상기와 같은 방법으로 흡광도를 측정하고 표준곡선을 작성하여 총 폴리페놀을 함량을 gallic acid equivalent 무게로 산출하였다. 총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(1999)의 방법을 응용하였다. 각각 희석한 시료액 300 µL와 증류수 300 µL를 희석한 후 5% sodium nitrite(NaNO₂) 30 µL와 10% aluminium chloride(AlCl₃) 30 µL를 혼합하였다. 대조구는 CFEX를 제외하고 증류수 300 µL만을 시약과 혼합하였다. 이 반응액에 1 M sodium hydroxide(NaOH) 200 µL를 혼합한 후 증류수를 첨가하여 1 mL로 맞춘 다음 spectrophotometer를 이용하여 510 nm에서 측정하였다. 표준물질은 quercetin을 사용하여 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하고 표준곡선을 작성하여 총 폴리페놀을 함량을 quercetin equivalent 무게로 산출하였다.

총 진세노사이드 함량

RGCON(70°Brix), CFEX(3°Brix), 꿀 및 물로 디자인된 혼합 처리구의 시료액을 20배의 70% 메탄올로 용해하여 사포닌을 충분히 용출시킨 후 membrane filter(0.20 μm pore size, Whatman Co., Kent, England)로 여과한 것을 액체크로마토그래프(HPLC, Agilent 1200, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)에 10 μL씩 주입하여 진세노사이드를 분석하였다. 분석에 사용한 칼럼은 ZORBOX Eclipse XDB-C18(4.6×150 mm, 5 μm, Agilent Technologies Inc., Philadelphia, PA, USA)이었으며, 검출기는 diode array detector(203 nm, Agilent 1200, Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 이동상으로는 Seong 등(2018)의 방법에 따라 용매 A(water)와 용매 B(acetonitrile)를 이용하여 용매 B를 0분(20%), 10분(20%), 25분(24%), 30분(33%), 42분(37%), 57분(80%), 58분(100%), 68분(60%), 70분(20%)의 조건으로 하였으며, 유속 1.0 mL/min으로 흘려주었다. 진세노사이드 표준시약으로는 Rg3(Chengdu Biopurify Biochemicals Ltd., Chengdu, China) 등 20종 사포닌을 이용하였고, 총 사포닌은 검출된 ginsenoside Rb1을 포함한 20종 사포닌의 총합으로 표현하였다(Jo 등, 2011).

항산화 활성 측정

항산화 활성으로 ABTS 라디칼 소거 활성, DPPH 라디칼 소거 활성, hydroxyl 라디칼 소거 활성 및 Fe²⁺ 킬레이트 활성 등을 측정하였다. 각 활성능을 100% 수준 안에 들게 하기 위해 각 처리구를 ABTS 라디칼 소거 활성은 120배로, DPPH 라디칼 소거 활성은 40배로, hydroxyl 라디칼 소거 활성 및 Fe²⁺ 킬레이트 활성은 20배로 각각 희석하여 활성 측정용 시료액으로 사용하였다. 또한 대조구로 25°Brix로 만든 홍삼 extract만의 스틱(RGEX)도 같은 희석배수로 항산화 활성을 측정 비교하였다. 즉, ABTS 라디칼 소거 활성은 ABTS 라디칼 양이온이 탈색화 되는 원리를 이용한 분석법(Re 등, 1999)을 응용하여 측정하였다. ABTS･⁺을 형성시키기 위해 7.4 mM의 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)와 2.6 mM potassium persulphate를 혼합하고 차광하여 24시간 이상 실온에서 ABTS･⁺을 형성시켰다. 실험 직전에 ABTS･⁺을 형성시킨 용액을 734 nm에서 흡광도 값이 1.00±0.02가 되도록 pH 7.4의 인산버퍼(PBS)로 희석하여 사용하였다. 120배로 희석한 용액 0.2 mL와 흡광도 값이 1.00±0.02인 ABTS･⁺용액 3 mL를 혼합한 다음 차광하여 10분간 상온에서 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하고, 초기 흡광도의 값에 대한 차이값을 백분율로 환산하여 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타냈다. DPPH 라디칼 소거 활성은 DPPH 자유라디칼 소거법(Brand-Williams 등, 1995)을 변용하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)에 대한 수소공여에 의한 전자소거능 효과를 측정하였다. 40배로 희석한 용액 1 mL와 EtOH에 녹인 100 µM의 DPPH 용액 3 mL를 혼합하여 교반한 뒤 30분간 암소에서 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하고, 초기 흡광도의 값에 대한 차이값을 백분율로 환산하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냈다. Hydroxyl 라디칼 소거 활성은 Smirnoff와 Cumbes(1989)의 방법을 변형하여 hydrogen peroxide(H₂O₂)와 iron(II) sulfate(FeSO₄) fenton 반응에 의해 유리되는 hydroxyl 라디칼을 측정하였다. 20배로 희석한 용액 0.5 mL, 9.0 mM FeSO₄ 1 mL, 9.0 mM sodium salicylate(C₇H₅NaO₃) 1 mL, 8.8 mM H₂O₂ 1 mL를 혼합하여 37°C에서 60분간 반응시켰다. 반응시킨 후 15,000×g에서 6분간 원심분리하여 510 nm에서 흡광도를 측정하고 hydroxyl 라디칼 소거 활성(%)은 다음 식으로 계산하였다.

$$\begin{array}{l}Hydroxyl라디칼소거활성\left(\%\right)=\frac{A_0-\left(A_x-A_{x0}\right)}{A_0}\times 100\\ A_0:시료무첨가구의흡광도\\ A_x:시료첨가구의흡광도\\ A_{x0}:반응시H_2{O}_2무첨가구의흡광도\end{array}$$

Fe²⁺ 킬레이트 활성은 Hus 등(2005)의 방법을 변형하여 측정하였다. 20배로 희석한 용액 2 mL와 2 mM FeCl₂ 2 mL를 혼합하여 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응액에 5 mM ferrozine을 0.1 mL 첨가하고 다시 상온에서 5분간 반응시킨 후 562 nm에서 흡광도를 측정한 다음, 초기 흡광도의 값에 대한 차이값을 백분율로 환산하여 Fe²⁺ 킬레이트 활성을 백분율(%)로 나타내었다.

통계처리

모든 실험의 통계 분석은 SPSS Statistics(ver. 25.0, IBM Corp., Armonk, NY, USA) 프로그램을 이용하여 평균과 표준편차를 산출하였다. 시료 간의 차이 검정은 일원배치 분산분석(analysis of variance; ANOVA)을 실시하였고, 분산 결과에 유의성이 나타나면 Duncan의 다중 범위 검정(Duncan’s multiple range test)을 이용하여 P<0.05 및 P< 0.001 수준에서 사후 검증하였다. 실험 자료의 분석 및 최적화는 Minitab 17 프로그램을 이용하여 독립변수와 종속변수와의 관계를 분산분석과 회귀분석을 통하여 1차 선형효과, 2차 곡선효과 및 인자 간 교호작용을 분석하여 평가하였다. 모델의 적합성은 F-test를 통하여 P<0.001 수준에서 검증하였고, 독립변수에 대한 종속변수의 반응표면 상태는 response surface plot으로 나타내었다.

°Brix, 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 진세노사이드 함량

CFEX을 첨가하여 항산화 활성을 향상시킨 홍삼 제품 제조 레시피를 확립하기 위하여 CFEX와 RGCON 및 꿀을 독립변수로 하여 20가지의 배합 비율로 홍삼 스틱 제품을 제조하였다. 모델링한 제품군에 대하여 °Brix를 측정하고 RGCON 및 CFEX의 유효성분인 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 진세노사이드 함량을 분석한 결과는 Table 2와 같았다. 각 조건에서 제조한 스틱 제품의 °Brix는 19.0~32.0이었고 총 폴리페놀 함량은 26.16~41.17 mg/g, 총 플라보노이드 함량은 3.58~3.93 mg/100 g, 총 진세노사이드 함량은 6.16~11.43 mg/g이었다. 모델링한 각 처리구의 °Brix, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 및 총 진세노사이드 함량에 대한 반응표면 분석 결과 Fig. 1과 Fig. 2에서 보는 바와 같이, CFEX는 브릭스가 낮은 관계로 첨가량이 증가하게 되면 처리구의 제품군들이 농도들이 낮아지는 것을 볼 수 있었고 홍삼농축액은 농도가 높으므로 첨가량이 많아질수록 처리구의 제품군들이 농도들이 높아지는 것을 볼 수 있었다. 또 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 진세노사이드 함량도 홍삼농축액이 농도가 높아 첨가량이 많아질수록 높아지는 경향이었으며 상대적으로 CFEX는 농도가 낮은 관계로 첨가량이 많아질수록 낮아지는 경향을 보여주었다. 설정된 반응별로 모델링화하여 °Brix 및 유효성분 함량에 대한 F-test로 유의성을 검증한 결과와 회귀식은 Table 3과 같았다. 처리구별로 °Brix, 총 폴리페놀 함량 및 총 진세노사이드 함량은 유의한 결과를 보여주었으나 총 플라보노이드 함량은 처리구별로 유의하지 않은 것으로 나타났다. 또한 Fig. 3에서 나타낸 바와 같이 독립변수 간의 교호작용에 대한 유의수준(P<0.05)을 분석해본 결과 °Brix는 CFEX･CFEX, CFEX, RGCON, RGCON･RGCON 및 Honey･Honey 순서대로 교호작용에 유의적이었으며, Honey 단독과 RGCON･CFEX의 교호작용에는 유의하지 않은 것으로 나타났다. 총 폴리페놀 함량은 RGCON 단독처리구만 유의하였고 그 외는 교호작용에 유의적이지 않았으며, 총 플라보노이드 함량은 각각 원료에 함유량이 낮아 모두 유의적이지 않았고 총 진세노사이드 함량은 CFEX･CFEX 처리구에서만 유의적인 것으로 나타나 전체적으로 국화 추출물의 첨가량이 최적화 모델링하는 독립변수에 가장 영향을 많이 끼치는 것을 볼 수 있었다.

Table 2 . Experimental data on °Brix, total polyphenol, total flavonoid, and total ginsenoside content of red ginseng concentrate stick products with Chrysanthmi Flos (CF) extract under different mixing conditions based on central composite design by response surface method.

Sample No.	Variables1)				Response
	RGCON (g)	CFEX (g)	Honey (g)	Water (g)	°Brix***	Total polyphenol*** (mg/g, GAE2))	Total flavonoid (mg/100 g, QE3))	Total ginsenoside*** (mg/g)
1	9	5	0.5	15.0	25	30.45±0.07e4)	3.73±0.08	8.14±0.02de
2	11	5	0.5	15.0	27	36.94±0.05c	3.93±0.09	10.40±0.06b
3	9	15	0.5	15.0	19	26.16±0.09g	3.79±0.11	6.56±0.10f
4	11	15	0.5	15.0	21.5	31.15±0.11e	3.91±0.14	7.79±0.11e
5	9	5	1.5	15.0	26.5	31.86±0.25d	3.76±0.06	8.88±0.06d
6	11	5	1.5	15.0	29.5	40.46±0.18a	3.85±0.07	9.92±0.04c
7	9	15	1.5	15.0	20	30.86±0.05e	3.76±0.12	6.23±0.13f
8	11	15	1.5	15.0	23	35.33±0.16d	3.84±0.17	7.52±0.10e
9	8	10	1.0	15.0	21	28.26±0.14f	3.58±0.10	6.74±0.08f
10	12	10	1.0	15.0	26.2	38.33±0.19b	3.81±0.09	9.28±0.04cd
11	10	0	1.0	15.0	32	41.17±0.02a	3.92±0.12	11.43±0.01a
12	10	20	1.0	15.0	19.3	32.55±0.23d	3.58±0.20	6.16±0.13f
13	10	10	0	15.0	22.1	32.17±0.14d	3.63±0.09	8.53±0.07d
14	10	10	2.0	15.0	25.2	37.95±0.10b	3.75±0.07	7.85±0.09de
15	10	10	1.0	15.0	23.9	35.10±0.11d	3.73±0.10	7.98±0.05de
16	10	10	1.0	15.0	23.8	35.15±0.15d	3.72±0.06	7.97±0.11de
17	10	10	1.0	15.0	24.4	35.09±0.13d	3.74±0.07	8.00±0.09de
18	10	10	1.0	15.0	24.1	35.02±0.16d	3.72±0.09	8.02±0.08de
19	10	10	1.0	15.0	24.1	35.01±0.11d	3.74±0.11	7.99±0.10de
20	10	10	1.0	15.0	24	35.18±0.19d	3.73±0.04	7.96±0.09de

¹⁾RGCON: red ginseng concentrate (70°Brix), CFEX: extract of CF (3°Brix)..

²⁾Gallic acid equivalents..

³⁾Quercetin equivalents..

⁴⁾Mean±SD (n=3). Mean values with different letters (a-g) within the same column are significantly different by Duncan’s multiple range test at ***P<0.001..

Table 3 . Polynomial equation by response surface methodology (RSM) program for on °Brix, total polyphenol, total flavonoid, and total ginsenoside content of red ginseng stick products added Chrysanthmi Flos (CF) extracts and honey under different mixing conditions.

Response1)	Model	R2	F-value	Prob>P	Polynomial equation2)
°Brix	Quadratic	0.9979	535.18***	<0.0001	7.29＋3.531X1－0.971X2－0.34X3－0.1375X12＋0.01450X22 －0.550X32＋0.0125X1X2＋0.375X1X3－0.0750X2X3
T-P	Quadratic	0.9168	12.25***	<0.0001	－65.4＋16.83X1＋0.60X2－1.1X3－0.651X12＋0.0096X22－0.84X32－0.141X1X2＋0.40X1X3＋0.197X2X3
T-F	Quadratic	0.5082	1.15	0.413	2.74＋0.103X1＋0.0052X2＋0.415X3＋0.0008X12＋0.000582X22－0.0018X32－0.00225X1X2－0.0375X1X3－0.0025X2X3
T-G	Quadratic	0.9873	86.20***	<0.0001	－0.48＋1.169X1－0.166X2＋2.76X3－0.0001X12＋0.00785X22＋0.180X32－0.0195X1X2－0.290X1X3－0.0430X2X3

¹⁾T-P: total polyphenol content (mg/g, gallic acid equivalents), T-F: total flavonoid content (mg/100 g, quercetin equivalents), T-G: total ginsenoside content (mg/g)..

²⁾X₁: RGCON, red ginseng concentrate (70°Brix), X₂: CFEX, extract of CF (3°Brix), X₃: honey..

^***P<0.001..

Fig 1. Response surface plots on °Brix and total polyphenol content of red ginseng stick products with Chrysanthmi Flos (CF) extracts under different mixing conditions. T-P: total polyphenol content (mg/g, GAE), RGCON: 8, 10, 12 added weight (g) of red ginseng concentrate (70°Brix), CFEX: 0, 10, 20 added weight (g) of extract of CF (3°Brix), Honey: 0, 1.0, 2.0 added weight (g).

Fig 2. Response surface plots on total flavonoid and total ginsenoside content of red ginseng stick products with Chrysanthmi Flos (CF) extracts under different mixing conditions. T-F: total flavonoid content (mg/100 g, QE), T-G: total ginsenoside content (mg/g), RGCON: 8, 10, 12 added weight (g) of red ginseng concentrate (70°Brix), CFEX: 0, 10, 20 added weight (g) of extract of CF (3°Brix), Honey: 0, 1.0, 2.0 added weight (g).

Fig 3. Standard pareto chart (P<0.05) by RSM program on °Brix, total polyphenol, total flavonoid, and total ginsenoside content of red ginseng stick products added Chrysanthmi Flos (CF) extracts and honey under different mixing conditions. Response factor of RGCON, CFEX, Honey marked A, B, and C, respectively. RGCON: red ginseng concentrate (70°Brix), CFEX: extract of CF (3°Brix), T-P: total polyphenol content (mg/g, gallic acid equivalents), T-F: total flavonoid content (mg/100 g, quercetin equivalents), T-G: total ginsenoside content (mg/g).

항산화 활성

RGCON과 CFEX 및 꿀을 독립변수로 하여 20가지의 배합 비율로 모델링하여 제조한 홍삼 스틱 제품군에 대하여 DPPH, ABTS 및 hydroxyl 라디칼 소거능과 Fe²⁺ 킬레이트 활성 등에 대한 항산화 활성을 측정하고 분석한 결과는 Table 4와 같았으며, 설정된 반응별로 모델링화하여 F-test로 유의성을 검증한 결과와 회귀식은 Table 5와 같았다. 항산화 활성 측정 시 ABTS, DPPH 및 hydroxyl 라디칼 소거능과 Fe²⁺ 킬레이트 활성이 각각 활성이 차이가 나타나는 것을 볼 수 있어서 각 제품군을 ABTS 라디칼 소거능은 120배, DPPH 라디칼 소거능은 40배, hydroxyl 라디칼 소거능과 Fe²⁺ 킬레이트 활성은 20배로 희석하여 측정 분석하였다. 각 조건에서 제조한 스틱 제품의 ABTS 라디칼 소거능은 66.18~97.18%였고, DPPH 라디칼 소거능은 57.93~83.59%, hydroxyl 라디칼 소거능은 10.26~23.48%였으며 Fe²⁺ 킬레이트 활성은 4.60~9.79%였다(Table 4). 모델링한 각 처리구의 °Brix, ABTS, DPPH 및 hydroxyl 라디칼 소거능과 Fe²⁺ 킬레이트 활성 대한 반응표면 분석 결과 Fig. 4와 Fig. 5에서 보는 바와 같이 CFEX는 브릭스가 낮은 관계로 첨가량이 증가하게 되면 처리구의 제품군들에 대한 ABTS 라디칼 소거능과 DPPH 라디칼 소거능이 홍삼농축액과 꿀의 양이 같은 조건일 때 감소하는 것을 볼 수 있었고, 홍삼농축액은 농도가 높으므로 첨가량이 많아질수록 CFEX와 꿀의 양이 같은 조건일 때 활성이 증가하는 것을 볼 수 있었으며, 꿀의 첨가량이 클수록 ABTS 라디칼 소거능은 홍삼농축액에 영향이 없었다. 설정된 반응별로 모델링화하여 항산화 활성에 대한 F-test로 유의성을 검증한 결과와 회귀식은 Table 5와 같았다. 처리구별로 °Brix, ABTS, DPPH 및 hydroxyl 라디칼 소거능은 유의한 결과를 보여주었으나 Fe²⁺ 킬레이트 활성은 처리구별로 유의하지 않은 것으로 나타났다. 또한 Fig. 6에 나타난 바와 같이 독립변수 간의 항산화 작용에 대한 교호작용(P<0.05)을 분석해본 결과, ABTS 라디칼 소거능은 CFEX･CFEX, CFEX, RGCON 및 Honey･Honey만 유의적으로 나타났고, 다른 독립변수 간에는 교호작용이 유의하지 않았다. DPPH 라디칼 소거능은 CFEX만 유의적이었고 hydroxyl 라디칼 소거능은 전체적으로 독립변수 간에 교호작용에 유의하지 않았으며, Fe²⁺ 킬레이트 활성은 RGCON･RGCON 및 RGCON에만 유의적으로 나타났다. 따라서 항산화 활성에 대한 독립변수에 영향을 주는 인자는 농도가 높은 홍삼농축액과 농도는 낮지만 양이 많이 첨가되는 국화 추출물이 변수에 영향을 많이 끼치는 것을 볼 수 있었다.

Table 4 . Experimental data on antioxidant activity of red ginseng stick products with Chrysanthmi Flos (CF) extracts under different mixing conditions based on central composite design by response surface analysis.

Sample No.	Variables1)				Response (antioxidative activity)2)
	RGCON (g)	CFEX (g)	Honey (g)	Water (g)	Radical scavenging activity			Fe2+ chelating*
					ABTS***	DPPH***	Hydroxyl***
1	9	5	0.5	15.0	80.00±0.03c3)	74.59±0.02b	12.34±0.04ef	7.67±0.07bc
2	11	5	0.5	15.0	94.38±0.75a	83.59±0.15a	14.12±0.11d	6.41±0.05cd
3	9	15	0.5	15.0	66.74±0.55d	57.93±0.22d	17.62±0.07b	6.91±0.09c
4	11	15	0.5	15.0	76.62±0.36c	72.84±0.39b	22.72±0.10a	5.86±0.10d
5	9	5	1.5	15.0	80.00±0.42c	74.68±0.38b	13.04±0.22e	7.88±0.05bc
6	11	5	1.5	15.0	89.66±0.10b	81.66±0.52a	15.61±0.16c	4.60±0.10e
7	9	15	1.5	15.0	65.06±0.21d	61.60±0.17c	21.31±0.25a	6.79±0.08c
8	11	15	1.5	15.0	75.95±0.16c	71.59±1.09bc	23.48±0.30a	7.61±0.11bc
9	8	10	1.0	15.0	66.40±1.06d	64.76±0.25c	15.76±0.12c	7.05±0.09c
10	12	10	1.0	15.0	89.22±1.14b	80.96±1.02a	19.40±0.28ab	7.44±0.05c
11	10	0	1.0	15.0	97.18±0.05a	82.79±0.58a	10.26±0.14f	8.45±0.08b
12	10	20	1.0	15.0	66.18±0.38d	64.30±0.14c	21.54±0.20a	7.12±0.12c
13	10	10	0	15.0	80.56±0.52c	73.73±0.23b	16.21±0.18bc	8.53±0.10b
14	10	10	2.0	15.0	78.43±0.28c	70.39±0.17bc	19.11±0.22ab	9.79±0.10a
15	10	10	1.0	15.0	77.76±0.33c	73.39±0.26b	17.49±0.18b	9.45±0.11a
16	10	10	1.0	15.0	77.71±0.51c	73.37±0.08b	17.36±0.10b	9.42±0.09a
17	10	10	1.0	15.0	77.76±0.17c	73.38±0.14b	17.41±0.09b	9.34±0.04a
18	10	10	1.0	15.0	77.79±0.25c	73.40±0.18b	17.39±0.15b	9.44±0.05a
19	10	10	1.0	15.0	77.84±0.52c	73.41±0.20b	17.42±0.13b	9.47±0.09a
20	10	10	1.0	15.0	77.79±0.26c	73.39±0.22b	17.50±0.04b	9.46±0.10a

¹⁾RGCON: red ginseng concentrate (70°Brix), CFEX: extract of CF (3°Brix)..

²⁾ABTS: radical scavenging activity of 120 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey, DPPH: radical scavenging activity of 40 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey, Hydroxyl: radical scavenging activity of 20 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey, Fe²⁺ chelating: activity of 20 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey..

³⁾Mean±SD (n=3). Mean values with different letters (a-f) within the same column are significantly different by Duncan’s multiple range test at ^*P<0.05, ^***P<0.001..

Table 5 . Polynomial equation by RSM program on antioxidant activity of red ginseng concentrates stick products added Chrysanthmi Flos (CF) extracts and honey under different mixing conditions.

Response1)	Model	R2	F-value	Prob>F	Polynomial equation2)
ABTS	Quadratic	0.9954	241.99***	<0.0001	21.7＋8.40X1－1.558X2＋3.70X3－0.050X12＋0.03672X22＋1.488X32－0.0816X1X2－0.928X1X3＋0.118X2X3
DPPH	Quadratic	0.9742	41.96***	<0.0001	25.4＋7.92X1－3.52X2＋17.6X3－0.192X12－0.0008X22－1.57X32＋0.223X1X2－1.74X1X3＋0.213X2X3
Hydroxyl	Quadratic	0.9675	33.05***	<0.0001	6.9－0.48X1＋0.092X2＋5.03X3＋0.073X12－0.01387X22＋0.373X32＋0.0730X1X2－0.535X1X3＋0.113X2X3
Fe2+ chelating	Quadratic	0.5466	1.34	0.326	－50.1＋12.93X1－0.80X2－0.3X3－0.711X12－0.0230X22－0.43X32＋0.1077X1X2－0.038X1X3＋0.162X2X3

¹⁾ABTS: radical scavenging activity of 120 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey, DPPH: radical scavenging activity of 40 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey, Hydroxyl: radical scavenging activity of 20 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey, Fe²⁺ chelating: activity of 20 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey..

²⁾X₁: RGCON, red ginseng concentrate (70°Brix), X₂: CFEX, extract of CF (3°Brix), X₃: honey..

^***P<0.001..

Fig 4. Response surface plots on antioxidant activity for ABTS and DPPH radical scavenging activity of red ginseng concentrates stick products with Chrysanthmi Flos (CF) extracts under different mixing conditions. RGCON: 8, 10, 12 added weight (g) of red ginseng concentrate (70°Brix), CFEX: 0, 10, 20 added weight (g) of extract of CF (3°Brix), Honey: 0, 1.0, 2.0 added weight (g).

Fig 5. Response surface plots on antioxidant activity for hydroxyl radical scavenging and Fe²⁺ chelating activity of red ginseng concentrates stick products with Chrysanthmi Flos (CF) extracts under different mixing conditions. RGCON: 8, 10, 12 added weight (g) of red ginseng concentrate (70°Brix), CFEX: 0, 10, 20 added weight (g) of extract of CF (3°Brix), Honey: 0, 1.0, 2.0 added weight (g).

Fig 6. Standard pareto chart (α=0.05) by RSM program on antioxidant activity of red ginseng stick products added Chrysanthmi Flos (CF) extracts and honey under different mixing conditions. Response factor of RGCON, CFEX, Honey marked A, B, and C, respectively. RGCON: red ginseng concentrate (70°Brix), CFEX: extract of CF (3°Brix). ABTS: radical scavenging activity of 120 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey, DPPH: radical scavenging activity of 40 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey, Hydroxyl: radical scavenging activity of 20 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey, Fe²⁺ chelating: activity of 20 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey.

국화 추출물 및 꿀이 첨가된 홍삼 스틱 제품의 최적화

홍삼 스틱 제품의 목적 농도인 25°Brix로 설정한 후 유효성분들에 대한 회귀분석 결과, 모두 독립변수가 상호작용을 하는 quardratic이 적합한 모델로 채택되었다. Table 6에서 보는 바와 같이 95% 예측구간은 °Brix가 24.50~26.59, 총 폴리페놀 함량은 28.98~44.45 mg/g, 총 플라보노이드 함량은 3.50~4.47 mg/100 g, 총 진세노사이드 함량은 10.39 ~12.51 mg/g이었고, 95% 신뢰구간은 °Brix가 24.49~24.61, 총 폴리페놀 함량은 29.76~43.77 mg/g, 총 플라보노이드 함량은 3.55~4.42 mg/100 g, 총 진세노사이드 함량은 10.50~12.41 mg/g이었다(Table 6). 이와 같이 제품의 농도 및 유효성분의 함량적인 면에서 볼 때 전체적으로 가장 적합한 배합비는 홍삼농축액, 국화 추출물 및 꿀이 각각 12 g, 5.8586 g, 0 g으로 꿀은 무첨가가 최적의 배합비 조건이었다. 이와 같은 조건의 배합비일 때 농도는 25.54°Brix, 총 폴리페놀 함량은 36.77 mg/g, 총 플라보노이드 함량은 3.99 mg/100 g 및 총 진세노사이드 함량은 11.45 mg/g을 나타내고 있었으며 전체적인 만족도는 0.8983으로 나타났다(Table 6). 홍삼 스틱 제품의 목적 농도인 25°Brix로 설정한 후 항산화 활성에 대한 회귀분석 결과는 모두 독립변수가 상호작용을 하는 quardratic이 적합한 모델로 채택되었으며(Table 7), 95% 예측구간은 °Brix, ABTS, DPPH 및 hydroxyl 라디칼 소거능과 Fe²⁺ 킬레이트 활성이 각각 24.42~25.58°Brix, 87.51~92.15%, 77.23~85.65%, 14.83~19.59% 및 3.66~11.42%인 것으로 나타났고, 95% 신뢰구간은 °Brix, ABTS, DPPH 및 hydroxyl 라디칼 소거능과 Fe²⁺ 킬레이트 활성이 각각 24.65~25.36, 88.40~91.26%, 78.85~84.02%, 15.75~18.67% 및 5.15~9.92%였다. 국화 추출물과 꿀이 첨가된 홍삼 스틱 제품의 항산화 활성은 ABTS 라디칼 소거능이 제품을 120배 희석한 조건에서도 90%대 수준이었고 DPPH는 40배 희석물에 대하여 80%대 수준이었으며, hydroxyl 라디칼 소거능과 Fe²⁺ 킬레이트 활성은 20배로 희석한 조건에서 각각 10%대와 5~10% 수준인 것으로 나타나 국화 추출물과 꿀이 첨가된 홍삼 스틱 모델링한 제품에 대해서는 ABTS 라디칼 소거능이 가장 우수한 것을 볼 수 있었다. 이처럼 25.0°Brix로 설정할 경우 홍삼농축액은 11.184 g, 국화 추출물은 8.050 g 및 꿀은 0.385 g이 항산화 활성을 최대로 향상시킬 수 있는 최적 배합비 조건이었다. 이와 같은 조건의 배합비일 때 농도는 25.0°Brix, ABTS, DPPH 및 hydroxyl 라디칼 소거능과 Fe²⁺ 킬레이트 활성이 각각 89.83%, 81.44%, 17.21% 및 7.54%를 나타내고 있었으며 전체적인 만족도는 0.7320으로 나타났다(Table 7).

Table 6 . Optimum constraint values using °Brix, total polyphenol, total flavonoid, and total ginsenoside content of red ginseng stick products added Chrysanthmi Flos (CF) extracts and honey.

		Goal	Optimization solution	95% CI3)	95% PI4)	Desirability
Variables1)	RGCON	In range	12
	CFEX	In range	5.8586
	Honey	In range	0
Response2)	°Brix	25	25.54	24.49∼24.61	24.50∼26.59
	T-P	Maximizer	36.77	29.76∼43.77	28.98∼44.45
	T-F	Maximizer	3.99	3.55∼4.42	3.50∼4.47
	T-G	Maximizer	11.45	10.50∼12.41	10.39∼12.51
Total desirability						0.8983

¹⁾RGCON: red ginseng concentrate (70°Brix), CFEX: extract of CF (3°Brix)..

²⁾T-P: total polyphenol content (mg/g, gallic acid equivalents), T-F: total flavonoid content (mg/100 g, quercetin equivalents), T-G: total ginsenoside content (mg/g)..

³⁾CI: confidence interval. ⁴⁾PI: prediction interval..

Table 7 . Optimum constraint values using antioxidant activity of red ginseng stick products added Chrysanthmi Flos (CF) extract and honey.

		Goal	Optimization solution	95% CI3)	95% PI4)	Desirability
Variables1)	RGCON	In range	11.1842
	CFEX	In range	8.0501
	Honey	In range	0.3852
Response2)	°Brix	25	25	24.65∼25.36	24.42∼25.58
	ABTS	Maximizer	89.83	88.40∼91.26	87.51∼92.15
	DPPH	Maximizer	81.44	78.85∼84.02	77.23∼85.65
	Hydroxyl	Maximizer	17.21	15.75∼18.67	14.83∼19.59
	Fe2+ chelating	Maximizer	7.54	5.15∼9.92	3.66∼11.42
Total desirability						0.732

¹⁾RGCON: red ginseng concentrate (70°Brix); CFEX, extract of CF (3°Brix)..

²⁾ABTS: ABTS radical scavenging activity of 120 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey, DPPH: DPPH radical scavenging activity of 40 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey, Hydroxyl: Hydroxyl radical scavenging activity of 20 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey, Fe²⁺ chelating: Fe²⁺ chelatingactivity of 20 times diluted red ginseng concentrates stick products with CF extracts and honey..

³⁾CI: confidence interval. ⁴⁾PI: prediction interval..

국화 추출물 및 꿀의 첨가로 최적화된 홍삼농축액 제품의 항산화 활성 비교

반응표면 실험계획법의 중심합성계획법에 따라 실시하여 도출해낸 최적화된 국화 추출물과 꿀을 홍삼농축액에 혼합하여 25°Brix의 농도로 만든 모델링 제품과 기존 홍삼농축액을 25°Brix의 농도로 만든 제품에 대하여 항산화 활성을 측정하여 비교･분석한 결과, 항산화 활성 중 ABTS 라디칼 소거능은 대조구인 홍삼액이 77.78±0.89%, 모델링하여 최적화된 제품은 89.82±1.25%로 약 12% 정도가 활성이 증가하였고, DPPH 라디칼 소거능은 홍삼액이 72.55±1.02%, 모델링하여 최적화된 제품은 81.46±1.88%로 약 9% 정도가 활성이 증가하였다. Hydroxyl 라디칼 소거능과 Fe²⁺ 킬레이트 활성은 각각 약간의 증가와 약간의 감소로 유의적으로 인정되지 않게 나타났다(Table 8).

Table 8 . Comparison of optimum modeling product and red ginseng extract on antioxidant activity.

Product	Antioxidant activity (%)3)
	ABTS	DPPH	Hydroxyl	Fe2+ chelating
OMP1)	89.82±1.25a4)	81.46±1.88a	17.19±0.56	7.55±0.22
RGEX2)	77.78±0.89b	72.55±1.02b	17.40±0.14	7.46±0.18

¹⁾OMP: optimum modeling product (25°Brix, RGCON 11.18 g＋CFEX 8.05 g＋honey 0.39 g＋water 15 g)..

²⁾RGEX: red ginseng extract (25°Brix, RGCON 13.89 g＋water 25 g)..

³⁾ABTS: radical scavenging activity of 120 times diluted, DPPH: radical scavenging activity of 40 times diluted, Hydroxyl: radical scavenging activity of 20 times diluted, Fe²⁺ chelating: activity of 20 times diluted..

⁴⁾Mean±SD (n=3). Mean values with different letters (a-b) within the same column are significantly different by Duncan’s multiple range test at P<0.01..

국화 추출물을 첨가하여 기존 홍삼액이 가지고 있는 항산화 활성을 향상시키고자 반응표면분석법(RSM)의 중심합성계획법을 이용하여 홍삼농축액, 국화 추출물 및 꿀의 혼합조건을 최적화하고 항산화 성분 및 항산화 활성을 측정하였다. RSM 분석 결과 최적화된 모델링 제품은 홍삼농축액(RGCON)의 사용량이 11.18 g, 국화 추출물 8.05 g, 꿀 0.39 g 및 물 15 g의 25°Brix 제품으로 기존 RGCON을 25°Brix로 조제할 경우 RGCON이 13.89 g인 것에 비하여 1 스틱 제품당 RGCON 2.71 g 정도를 줄일 수 있는 효과를 보였으며, 도출해낸 모델링 제품에 대하여 항산화 활성이 각각 120배로 희석된 제품에서 ABTS 라디칼 소거능과 40배로 희석된 제품에서 DPPH 라디칼 소거능이 각각 12% 및 9% 정도 향상됨을 볼 수 있었다. 이와 같이 RGCON의 사용량을 줄이는 반면 항산화 활성이 향상된 제품을 제조할 수 있어 항산화 활성의 기능적인 면과 경제적인 면으로 효과적인 제품을 개발할 수 있는 것으로 판단된다.