2021년 건강보험심사평가원에서 발표한 통계에 따르면 퇴행성 관절염 환자수가 60세 이상의 연령대에서 급격하게 증가하였고 특히 70대가 가장 큰 비중을 차지하는 것으로 나타났다. 골 관절염(osteoarthritis)은 만성 퇴행성 질환 중 하나이며, 연골의 점차적인 소실로 인한 염증성 질환으로 통증 및 부종(edema), 관절강직(joint stiffness) 등이 동반된다. 염증(inflammation)은 세균 감염, 물리·화학적 손상 등 다양한 외부 자극에 대해 인체를 보호하기 위한 자연스러운 방어 기전으로, 염증 반응이 일어나는 동안 cyclooxygenase(COX)에 의해 생성되는 prostaglandin(PG)과 같은 생리활성물질, interleukin(IL) 및 tumor necrosis factor (TNF)-α와 같은 사이토카인, 전사인자(nuclear factor kappa-chain enhacer of activated B cell, NF-κB), 금속단백질분해효소(metalloproteinase, MMPs) 및 단백질가수분해효소(proteolytic enzymes) 등이 생성된다(Jung, 2017; Guzman 등, 2003; Somasundaram 등, 2020). In vitro 실험에서 염증 반응을 재현할 때 주로 사용되는 물질로는 H₂O₂, lipopolysaccharide(LPS) 등이 있으며, H₂O₂는 미토콘드리아에서 발생하는 중간대사산물 중 하나지만 과도하게 발생하게 되면 산화적 스트레스가 발생하며, LPS는 세포벽의 구성 성분 중 하나로 세포를 자극하여 염증 매개인자들을 발현시키는 대표적인 물질이다(Mathy-Hartert 등, 2003; Kwon, 2016).

관절염을 치료하는 방법으로는 소파관절 성형술, 인공관절 치환술, 활막 절제술 등과 같은 수술적 치료 또는 관절 내 주사하는 스테로이드(steroid), 히알루론산(hyaluronic acid), 경구용 비스테로이드성 항염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs), 진통제 등과 같은 약물적 치료가 있으나 수술적인 방법은 합병증과 감염 등과 같은 위험이 따르고 약물적 치료는 일시적이며 과민반응, 면역체계 악화, 인지장애, 소화기-심혈관계 이상 등과 같은 부작용의 위험이 있다(Castañeda 등, 2012; Bloom, 1989; Fries, 1991). 이러한 이유로 안전하면서도 효능이 입증된 건강기능식품과 같은 대체의학에 대한 수요 및 기호도가 증가하는 추세이다(Nam 등, 2012; Cho, 2019; Lee 등, 2020).

오미자[Schisandra chinensis (Turcz.) Baillon]는 아시아 지역(우리나라 포함)에서 오랫동안 다양한 질병의 치료 및 예방 목적으로 널리 사용되어온 열매로, schizandrin A, B, C, epigomisin, deoxyzschizandrin, schizandrol 등 다양한 lignan 화합물과 색소, 기름, 정유 등 다양한 성분이 함유되어 있어 여러 가지 약리적 기능이 있다. 오미자는 간 보호 효과, 알코올 해독, 혈당 저하, 콜레스테롤 저하, 면역 조절, 항암 및 고지혈증 완화 등과 같은 다양한 생리적 활성에 관해 연구되어 왔다(Kim 등, 2000; Moon, 1999; Hikino 등, 1984; Mok, 2005).

본 연구에서는 rats의 관절에서 primary 한 연골세포를 이용하여 오미자 주정 추출물이 연골 생성 및 분해 관련 인자와 염증 관련 인자에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

재료 및 추출

오미자[Schisandra chinensis (Turcz.) Baillon, SB] 추출물은 (주)바이오포트코리아(Busan, Korea)에서 제공받았다. 건조된 오미자를 20% 주정으로 90°C에서 4시간 동안 추출한 후 여과하였다. 여과된 추출물은 감압농축 후 동결건조하여 분말화하여 사용하였다.

연골세포(chondrocyte) 분리 및 배양

연골세포 분리를 위해 (주)새론바이오(Uiwang, Korea)로부터 5주령의 수컷 Sprague Dawley(SD) rat을 공급받아 호흡마취기기(NORVAP, North Yorkshire, UK)와 isoflurane(Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA)을 이용하여 희생시킨 뒤, 뒷다리 무릎 관절이 드러나도록 한 후 관절 끝부분의 연골을 1~2 mm 정도 얇게 채취하였다. 채취한 연골은 0.25% trypsin(HyClone Laboratories, Logan, UT, USA)과 0.1% EDTA-CMF(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로 처리한 후 2 mg/mL collagenase(Sigma-Aldrich Co.)를 첨가하여 100 rpm shaker에서 overnight 하였고, 이후 얻어진 세포 부유액을 Hank’s balanced salt solution(HyClone Laboratories)과 함께 100 μm pore size cell strainer(BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA)에 여과한 후 연골세포를 분리하였다. 분리한 연골세포는 각각 1%의 penicillin-streptomycin(HyClone Laboratories), 1 M HEPES(HyClone Laboratories), 200 mM L-glutamine(HyClone Laboratories)과 10% fetal bovine serum(Gibco, Waltham, MA, USA)을 첨가한 DMEM(HyClone Laboratories)을 넣은 75T flask에서 5% CO₂, 37°C 조건에서 배양하였으며 passage는 5 이하로 사용하였다. 본 연구는 경희대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다(KHUASP-21-189).

Cell viability 측정

SB의 세포독성 및 세포사멸에 대한 억제능을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 먼저 세포독성 평가를 위해 분리한 연골세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/well로 분주하고 overnight 하여 안정화시킨 후 각 well에 SB를 농도별로 처리한 후 24시간 배양하였다. 그 다음 5 mg/mL 농도의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 시약을 20 μL씩 처리하여 최대 4시간 동안 5% CO₂, 37°C에서 배양하였다. MTT 시약과 배지를 모두 제거한 후 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 200 μL씩 처리하여 540 nm에서 ELISA reader(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 세포사멸에 대한 억제능을 위해 분리한 연골세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/well로 분주하고 overnight 하여 안정화시킨 후 각 well에 세포에 독성이 나타나지 않는 적정 농도별로 추출물을 처리한 후 24시간 배양하였다. 그 후 200 μM H₂O₂를 2시간 처리한 다음 MTT 20 μL씩 처리하여 최대 4시간 동안 5% CO₂, 37°C에서 배양하였다. MTT 시약과 배지를 모두 제거한 후 DMSO를 200 μL씩 처리하여 540 nm에서 ELISA reader(Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α) 측정

Chondrocytes 세포를 배양하여 6-well plate에 5×10⁵ cells/well씩 분주하고 overnight 하여 안정화시킨 뒤, 양성대조군인 acetylsalicylic acid 10 µM 및 SB를 50, 100, 200 µg/mL 농도로 처리하고 LPS를 50 µg/mL 농도로 함께 처리하였다. 24시간 뒤 상층액을 이용하여 IL-1β, IL-6, TNF-α의 분비량을 Duoset ELISA kit(R&D System, Minneapolis, MN, USA)을 사용하여 655 nm에서 ELISA reader(Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 측정하였다.

PGE₂ 및 NO 측정

Chondrocytes 세포를 배양하여 6-well plate에 5×10⁵ cells/well씩 분주하고 overnight 하여 안정화시킨 뒤, 양성대조군인 acetylsalicylic acid 10 µM 및 SB를 50, 100, 200 µg/mL 농도로 처리하고 LPS를 50 µg/mL 농도로 함께 처리하였다. 24시간 뒤 상층액을 이용하여 PGE₂의 분비량을 Prostaglandin E2 Parameter Assay kit(R&D System)을 사용하여 ELISA reader로 측정하였고, NO의 분비량은 assay buffer를 이용하여 세포를 수집한 후 원심분리(13,000 rpm, 5 min, 4°C)하여 얻은 상층액으로 Nitric Oxide Assay kit(Abcam, Cambridge, UK)을 사용하여 ELISA reader(Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 측정하였다.

Real-time polymerase chain reaction에 의한 유전자 발현 측정

Chondrocytes 세포를 6-well plate에 5×10⁵ cells/well 씩 분주하고 overnight 하여 안정화시킨 뒤 양성대조군인 acetylsalicylic acid 10 µM 및 SB를 50, 100, 200 µg/mL 농도로 처리하고, H₂O₂를 200 µM의 농도로 2시간 동안 처리하였다. RNasy Mini kit(QIAGEN, Hilden, Germany)을 이용하여 RNA를 추출한 뒤 iScript™ cDNA Synthesis kit(Bio-Rad)을 이용하여 cDNA로 합성하였다. 유전자의 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용한 실시간 정량 PCR을 실시하였고, 기기는 CFX Connect^TM real-time PCR detection system(Bio-Rad Laboratories)을 사용하였다.

유전자 증폭 반응에 사용할 각각의 primer 염기서열은 Table 1에 나타내었다. 95°C에서 10분 동안 hot start 한 후 95°C에서 15초, 57°C에서 15초, 72°C에서 30초간 40 cycling으로 PCR 분석을 하였다. 모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 하였다. 결과의 분석은 CFX Maestro™ Analysis Software(Bio-Rad Laboratories)로 분석하였다.

Table 1 . Primer sequences used in RT-PCR quantification of mRNA.

Gene	Primer sequences
Aggrecan	F: 5′-GAA GTG TCC AAA CCA A-3′
	R: 5′-CGT TCC ATT CAC CCC TCT CA-3′
Collagen type Ⅰ	F: 5′-GAG CGG AGA GTA CTG GAT CGA-3′
	R: 5′-CTG ACC TGT CTC CAT GTT GCA-3′
Collagen type Ⅱ	F: 5′-GCA ACA GCA GGT TCA CGT ACA-3′
	R: 5′-TCG GTA CTC GAT GAT GGT CTT G-3′
MMP-3	F: 5′-GAG TGT GGA TTC TGC CAT TGA G-3′
	R: 5′-TTA CAG CCT CTC CTT CAG AGA-3′
MMP-13	F: 5′-TGA TGG GCC TTC TGG TCT TCT-3′
	R: 5′-CCC CGC CAA GGT TTG G-3′
TIMP-1	F: 5′-AAG GGC TAC CAG AGC GAT CA-3′
	R: 5′-ATC GAG ACC CCA AGG TAT TGC-3′
TIMP-3	F: 5′-GAC CGA CAT GCT TC CAA TTT C-3′
	R: 5′-GCT GCA GTA GCC ACC CTT CT-3′
GAPDH	F: 5′-TGG CCT CCA AGG AGT AAG AAA C-3′
	R: 5′-CAG CAA CTG AGG GCC TCT CT-3′

Western blot에 의한 단백질 발현 측정

Chondrocytes 세포를 6-well plate에 5×10⁵ cells/well 씩 분주하고 overnight 하여 안정화시킨 뒤 양성대조군인 acetylsalicylic acid 10 µM 및 SB를 50, 100, 200 µg/mL 농도로 처리하고 H₂O₂는 200 µM의 농도로 2시간, LPS는 50 µg/mL의 농도로 24시간 처리하였다. 그다음 배지를 제거하고 protease inhibitor가 첨가된 lysis buffer를 넣고 균질화하여 ice에 두고 일정 시간 유지 후 원심분리(12,000 rpm, 20 min, 4°C)하여 단백질을 분리하였다. 단백질 정량은 BSA와 Bio-Rad protein assay Dye Reagent Concentrate(Bio-Rad)를 이용하여 Bradford 법(Kielkopf 등, 2020)으로 정량하였다. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel(SDS-PAGE, 10%)을 이용하여 각 샘플당 20 μL씩 loading 하여 전기영동으로 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 단백질을 전이한 후, TBST buffer에 용해시킨 5% skim milk(TBS containing 0.5% Tween 20)로 1시간 동안 blocking을 하고 1차 항체 IkBα, p65, COX-2, iNOS, MMP’s(3, 13), β-actin(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)을 상온에서 3시간 반응시킨 뒤 membrane을 HRP가 중합된 2차 항체(Cell Signaling Technology)에 60분간 반응시키고, enhanced chemiluminescent(ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)를 이용해 발색한 후 Easy photo를 사용하여 촬영하였다. 촬영된 Western blot band 이미지들은 Image J software(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 band의 밀도를 측정하였다.

통계처리

본 실험 결과의 분석은 통계프로그램 SPSS(Statistical Package for Social Science, version 25.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하였으며, 각 실험 항목의 측정 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로 표시하였다. 그룹 간 평균 차이는 one-way ANOVA로 확인하였고 통계적 유의 성은 Duncan’s multiple range test를 실시하여 P<0.05 수준에서 검정하였다.

세포독성 평가

Rat 무릎 관절에서 primary culture 한 연골세포를 이용하여 SB의 세포독성 및 세포사멸에 대한 억제능을 확인하기 위해 MTT를 실시한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. SB를 처리하지 않은 Normal control(NC)군과 시료의 용매로 쓰인 1% DMSO를 비교한 결과, 유의적인 차이를 보이지 않았기에 1% DMSO가 세포에 영향을 미치지 않았음을 확인하였다. SB를 처리하지 않은 NC군에 비해 SB 추출물을 처리한 군들은 200 μg/mL 농도부터 세포 생존율이 80% 이하로 나타났다. 그러나 200 μg/mL 농도는 100 μg/mL 농도와 유의적인 차이가 나타나지 않아 50, 100, 200 μg/mL를 실험진행 농도로 설정하였다. SB의 세포사멸 억제능을 측정한 결과, NC군에 비해 H₂O₂를 처리한 Control(C)군이 유의적으로 감소하여 H₂O₂에 의한 세포 손상이 일어났음을 확인하였다. SB50, SB100, SB200 처리군은 C군에 비해 각각 25.7%, 60.4%, 56.2% 유의적으로 증가하여 세포사멸 억제능이 나타났다.

Fig 1. Effect of Schisandra chinensis (Turcz.) Baillon ethanol extracts (SB) on the cell viability in chondrocyte. Primary culture chondrocytes were isolated from rat knee joints. (A) The chondrocyte was treated various concentration (0∼1,000 μg/mL) of SB. (B) The chondrocyte was treated various concentration (50, 100, 200 μg/mL) of SB. Chondrocyte treated for 24 h with SB were incubated for 2 h with 200 µM H₂O₂ except NC. NC: normal control, C: control; 200 µM H₂O₂. Cell viability was analyzed by MTT method. The results were expressed in mean±SD values. Significance were indicated using Duncan’s multiple range test at P<0.05.

오미자 추출물이 염증성 사이토카인, PGE2 및 NO 분비에 미치는 영향

Primary culture 한 연골세포인 chondrocytes에서 SB가 염증성 사이토카인, PGE₂ 및 NO 분비에 미치는 영향을 알아보기 위해 LPS 처리 후 IL-1β, IL-6, TNF-α 분비량을 측정한 결과는 Fig. 2에 나타내었다.

Fig 2. Effect of Schisandra chinensis (Turcz.) Baillon ethanol extracts (SB) on (A) IL-1β, (B) IL-6, (C) TNF-α, (D) PGE₂, and (E) NO production in LPS-treated chondrocyte. Primary culture chondrocytes were isolated from rat knee joints. The chondrocyte was treated 50 μg/mL LPS except NC and incubated for 24 h with 10 μM of PC (acetylsalicylic acid) and various concentration (50, 100, 200 μg/mL) of SB. NC: normal control, C: control; 50 μg/mL LPS. The results were expressed in mean±SD values. Significance were indicated using Duncan’s multiple range test at P<0.05.

IL-1β 분비량 측정 결과(Fig. 2A), NC에 비해 C군에서 유의적으로 증가하여 LPS에 의한 염증 반응이 일어났음을 확인하였다. 양성대조군(positive control, PC) 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 52.3%, 10.6%, 25.9%, 30.6% 감소하였다. SB50을 제외한 PC, SB100, SB200 처리군은 C군과 유의적인 차이가 있음을 확인하였다. IL-6 분비량을 측정한 결과(Fig. 2B), NC에 비해 C군에서 유의적으로 증가하여 LPS에 의한 염증 반응이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 48.9%, 10.3%, 19.6%, 31.1% 유의적으로 감소하였다. TNF-α 분비량을 측정한 결과(Fig. 2C), NC에 비해 C군에서 유의적으로 증가하여 LPS에 의한 염증 반응이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 46.2%, 9.7%, 27.2%, 29.2% 유의적으로 감소하였다. PGE₂ 분비량을 측정한 결과(Fig. 2D), NC에 비해 C군에서 유의적으로 증가하여 LPS에 의한 염증 반응이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 54.6%, 10.5%, 28.4%, 33.5% 감소하였다. SB50을 제외한 PC, SB100, SB200 처리군은 C군과 유의적인 차이가 있음을 확인하였다. NO 분비량을 측정한 결과(Fig. 2E), NC에 비해 C군에서 유의적으로 증가하여 LPS에 의한 염증 반응이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 51.3%, 7.5%, 24.5%, 31.5% 유의적으로 감소하였다.

오미자 추출물이 연골 생성 관련 유전자 발현에 미치는 영향

Primary culture 한 연골세포인 chondrocytes에서 SB가 연골 생성 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 H₂O₂ 처리 후 연골 생성 관련 인자인 aggrecan, collagen type Ⅰ,Ⅱ 유전자 발현을 측정한 결과는 Fig. 3에 나타내었다.

Fig 3. Effect of Schisandra chinensis (Turcz.) Baillon ethanol extracts (SB) on mRNA expression of (A) aggrecan, (B) collagen type Ⅰ, and (C) collagen type Ⅱ in H₂O₂-treated chondrocyte. Primary culture chondrocytes were isolated from rat knee joints. The chondrocyte was treated 200 μM H₂O₂ except NC and incubated for 24 h with 10 μM of PC (acetylsalicylic acid) and various concentration (50, 100, 200 μg/mL) of SB. NC: normal control, C: control; 200 µM H₂O₂. The results were expressed in mean±SD values. Significance were indicated using Duncan’s multiple range test at P<0.05.

Aggrecan의 유전자 발현을 측정한 결과(Fig. 3A), NC군에 비해 C군에서 유의적으로 감소하여 H₂O₂에 의해 세포 손상이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 109.7%, 8.8%, 55.1%, 73.0% 증가한 결과를 보였으며, SB50을 제외한 PC, SB 100, SB200 처리군은 C군과 유의적인 차이가 있음을 확인하였다. Collagen type Ⅰ 유전자 발현을 측정한 결과(Fig. 3B), NC군에 비해 C군에서 유의적으로 감소하여 H₂O₂에 의해 세포 손상이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 103.4%, 14.3%, 41.0%, 65.4% 유의적으로 증가하였다. Collagen type Ⅱ 유전자 발현을 측정한 결과(Fig. 3C), NC군에 비해 C군에서 유의적으로 감소하여 H₂O₂에 의해 세포 손상이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 96.9%, 12.7%, 65.2%, 44.4% 증가한 결과를 보였으며, SB50을 제외한 PC, SB100, SB200 처리군은 C군과 유의적인 차이가 있음을 확인하였다.

오미자 추출물이 연골 분해 관련 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향

Primary culture 한 연골세포인 chondrocytes에서 SB가 연골 분해 관련 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 H₂O₂ 처리 후 연골 분해 관련 인자인 MMP-3, MMP-13, TIMP-1, TIMP-3 유전자 및 단백질 발현을 측정한 결과는 Fig. 4, Fig. 5에 나타내었다.

Fig 4. Effect of Schisandra chinensis (Turcz.) Baillon ethanol extracts (SB) on mRNA expression of (A) MMP-3, (B) MMP-13, (C) TIMP-1, and (D) TIMP-3 in H₂O₂-treated chondrocyte. Primary culture chondrocytes were isolated from rat knee joints. The chondrocyte was treated 200 μM H₂O₂ except NC and incubated for 24 h with 10 μM of PC (acetylsalicylic acid) and various concentration (50, 100, 200 μg/mL) of SB. NC: normal control, C: control; 200 µM H₂O₂. The results were expressed in mean±SD values. Significance were indicated using Duncan’s multiple range test at P<0.05.

Fig 5. Effect of Schisandra chinensis (Turcz.) Baillon ethanol extracts (SB) on protein expression of (A) MMP-3 and (B) MMP-13 in H₂O₂-treated chondrocyte. Primary culture chondrocytes were isolated from rat knee joints. The chondrocyte was treated 200 μM H₂O₂ except NC and incubated for 24 h with 10 μM of PC (acetylsalicylic acid) and various concentration (50, 100, 200 μg/mL) of SB. NC: normal control, C: control; 200 µM H₂O₂. The results were expressed in mean±SD values. Significance were indicated using Duncan’s multiple range test at P<0.05.

MMP-3 유전자 발현을 측정한 결과(Fig. 4A), NC군에 비해 C군이 유의적으로 증가하여 H₂O₂에 의해 세포 손상이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 45.5%, 10.7%, 23.9%, 27.5% 유의적으로 감소하였다. MMP-3 단백질을 측정한 결과(Fig. 5A), NC군에 비해 C군이 유의적으로 증가하여 H₂O₂에 의해 세포 손상이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 34.2%, 11.6%, 28.0%, 30.7% 유의적으로 감소하였다. MMP-13 유전자 발현을 측정한 결과(Fig. 4B), NC군에 비해 C군이 유의적으로 증가하여 H₂O₂에 의해 세포 손상이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 45.1%, 7.4%, 19.8%, 31.0% 유의적으로 감소하였다. MMP-13 단백질을 측정한 결과(Fig. 5B), NC군에 비해 C군이 유의적으로 증가하여 H₂O₂에 의해 세포 손상이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 23.4%, 6.4%, 26.6%, 22.4% 감소한 결과를 보였으며, SB50을 제외한 PC, SB100, SB200 처리군은 C군과 유의적인 차이가 있음을 확인하였다. TIMP-1 유전자 발현을 측정한 결과(Fig. 4C), NC군에 비해 C군이 유의적으로 감소하여 H₂O₂에 의해 세포 손상이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 106.6%, 26.7%, 59.0%, 81.4% 유의적으로 증가하였다. TIMP-3 유전자 발현을 측정한 결과(Fig. 4D), NC군에 비해 C군이 유의적으로 감소하여 H₂O₂에 의해 세포손상이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 88.3%, 26.3%, 53.8%, 53.9% 유의적으로 증가하였다.

오미자 추출물이 염증 관련 단백질 발현에 미치는 영향

Primary culture 한 연골세포인 chondrocytes에서 SB가 염증 관련 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 LPS 처리 후 연골 분해 관련 인자인 IκBα, p65, COX-2, iNOS 단백질 발현을 측정한 결과는 Fig. 6에 나타내었다.

Fig 6. Effect of Schisandra chinensis (Turcz.) Baillon ethanol extracts (SB) on protein expression of (A) IκB, (B) p65, (C) COX-2, and (D) iNOS in LPS-treated chondrocyte. Primary culture chondrocytes were isolated from rat knee joints. The chondrocyte was treated 50 μg/mL LPS except NC and incubated for 24 h with 10 μM of PC (acetylsalicylic acid) and various concentration (50, 100, 200 μg/mL) of SB. NC: normal control, C: control; 50 μg/mL LPS. The results were expressed in mean±SD values. Significance were indicated using Duncan’s multiple range test at P<0.05.

IκBα의 단백질 발현량을 측정한 결과(Fig. 6A), NC군에 비해 C군이 유의적으로 증가하여 LPS에 의해 세포 손상이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 19.9%, 24.2%, 33.4%, 25.1% 유의적으로 감소하였다. p65의 단백질 발현량을 측정한 결과(Fig. 6B), NC군에 비해 C군이 유의적으로 증가하여 LPS에 의해 세포 손상이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 28.4%, 24.6%, 35.9%, 28.0% 유의적으로 감소하였다. COX-2의 단백질 발현을 측정한 결과(Fig. 6C), NC군에 비해 C군이 유의적으로 증가하여 LPS에 의해 세포 손상이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 35.0%, 22.1%, 24.4%, 27.7% 유의적으로 감소하였다. iNOS의 단백질 발현을 측정한 결과(Fig. 6D), NC군에 비해 C군이 유의적으로 증가하여 LPS에 의해 세포 손상이 일어났음을 확인하였다. PC 및 SB50, SB100, SB200 처리군에서 C군에 비해 각각 25.0%, 11.4%, 22.5%, 20.8% 유의적으로 감소하였다.

경제협력기구(OECD)의 조사에서 2019년 80세 이상의 초고령 인구는 전체 인구 중 1.85%(약 1억 4,144만 명)이나 2060년에는 3.3배 이상 급증한 4.76%(약 4억 7,440만 명)로 예측하며, 이러한 인구 고령화는 의학의 발전과 생활환경의 개선에 따른 것으로 보고하였다(OECD, 2021). 이러한 인구 고령 시대에 접어들면서 노인성 치매, 당뇨병, 고혈압, 골다공증, 퇴행성 관절염(골관절염) 등 노인성 질환이 증가하고 있으며, 특히 퇴행성 관절염은 노인성 질환 유병률 2위를 차지하고 있다. 퇴행성 관절염은 연골이 닳아 없어지고 염증이 발생하여 통증 및 부종이 발생하는 만성적인 질환으로 다양한 약물 및 수술 요법이 있으나, 약물 요법은 일시적일 뿐만 아니라 다양한 부작용이 나타나고 수술 요법은 감염 및 출혈 등의 합병증이 발생하며 고령자일수록 이러한 합병증이 증가하는 것으로 알려져 있다(Castañeda 등, 2012; Jeon 등, 2014). 따라서 이러한 부작용 및 합병증을 해결하기 위해 여러 연구자는 천연물을 통한 퇴행성 관절염 증상을 완화하고 진행을 지연시킬 수 있는 의약품 및 건강기능식품의 소재 개발을 활발히 진행하고 있다. 연골세포 생성 인자인 aggrecan 및 collagen의 발현 증가와 연골 분해 인자인 MMPs의 발현 억제, 염증 관련 사이토카인 및 NF-κB 등 전사인자의 발현 억제 등이 퇴행성 관절염 연구의 핵심이며, 본 연구에서도 이러한 기전에 따라 세포사멸을 위한 H2O2 및 세포 내 염증 반응을 위한 LPS로 유도된 연골세포에서 오미자 추출물이 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다.

염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, TNF-α는 연골세포 분해 작용을 일으키며, 특히 TNF-α는 다른 사이토카인을 분비하거나 NF-κB를 활성화하여 염증 매개 물질인 PGE₂, COX-2, iNOS 등을 생성하여 염증 반응을 일으킨다(Lawrence 등, 2005; Lu 등, 2008). IL-1β는 연골 파괴 인자인 MMPs와 aggrecanase 등의 발현을 증가시키고, MMP는 연골 및 골의 기질 구성요소를 파괴하는 단백분해효소로 혈관생성, 생식, 기관 형성, 조직 흡수 및 재형성 등의 과정에 주요한 역할을 하며, MMPs는 TIMPs에 의해 억제된다. 그러나 관절염이 발생하면 TIMPs는 억제되고 MMP의 발현은 증가하기 때문에 MMPs 활성의 억제 및 TIMPs 활성 증가가 연골 보호에 핵심적인 기전 중 하나이다(Giannelli 등, 2004; Jeong 등, 2017). LPS에 의해 염증이 발생하는데, LPS 수용체를 통해 전달된 활성화 신호는 inhibitor κB kinase(IKK)를 통해 I-κB를 인사화시키고 NF-κB를 활성화한다. 활성화된 NF-κB는 핵으로 이동하여 TNF-α를 생성시킨다. 염증 반응 초기에 NF-κB는 COX-2와 iNOS와 이에 의한 친염증성 매개물(proinflammaroy mediator)들을 생산하여 염증 반응을 유발한다(Gilmore, 1999; Kim 등, 2003; Chae, 2005). 연골 형성과 관련된 동화작용 인자로 aggrecan과 collagen type Ⅰ, Ⅱ가 있는데, aggrecan은 연골 기질을 구성하는 proteoglycan core protein의 하나이며, collagen은 연골 대부분을 차지하는 단백질이다(Abaskharoun 등, 2010; Ariyoshi 등, 2010). 관절염을 유발하기 위해 H2O2 및 LPS로 유도된 연골세포에서 오미자 추출물을 처리한 결과 염증성 사이토카인 및 연골 파괴 인자들이 감소하였고 동화작용 인자들은 증가한 결과를 보여, 오미자 추출물이 염증 및 연골 파괴 억제, 연골 생성에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

골관절염은 단백질가수분해효소, 금속단백분해효소 및 염증성 사이토카인이 복합적으로 관여하는 만성질환으로 통증 및 부종을 동반한다. 골관절염의 주요 치료 목표는 통증 감소 및 관절 운동 유지이며, 치료 약물로는 주로 비스테로이드성 항염제를 처방하고 있으나 장기 복용 시 부작용이 따른다. 최근 장기간 복용을 하더라도 부작용이 적은 연골 건강 관련 건강기능식품 개발이 활발히 일어나고 있다. 본 연구에서는 오미자 추출물을 이용하여 연골세포의 항염증 효능을 확인하고자 연구를 진행하였다. Primary 한 연골세포에 오미자 추출물을 처리한 후 염증성 사이토카인과 MMPs와 같은 염증 관련 인자들의 발현을 감소시켜 염증에 의한 연골 분해를 억제하는 데 도움을 주는 것을 확인하였다. 그리고 연골 생성과 관련된 인자인 aggrecan 및 collagen의 발현을 증가시켜 외부 자극에 의한 손상으로부터 연골 보호 효과에 대한 활성을 확인하였다. 또한 염증 반응에 관여하는 NF-κB 활성 또한 감소시켜 항염증 효과에도 영향을 미친 것을 확인하였다. 이상의 결과는 오미자 추출물이 관절 건강에 도움을 줄 수 있는 천연 기능성 식품의 소재로서 기대 가치가 있을 것으로 보인다.