Ex) Article Title, Author, Keywords
Online ISSN 2288-5978
Ex) Article Title, Author, Keywords
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2021; 50(6): 543-550
Published online June 30, 2021 https://doi.org/10.3746/jkfn.2021.50.6.543
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
Su Jung Lee1 , Gyoo Taik Kwon1, Yi Hyung Chung2, Jong-Sang Yoo3, Kyung-Hoon Cho3, Young-Suk Kim4, and Han Su Jang2
1Berry & Biofood Research Institute, 2Jeonbuk Institute for Food-Bioindustry, 3Daehan Feed Co., Ltd. 4Department of Food Science and Technology, Chonbuk National University
Correspondence to:Han Su Jang, Jeonbuk Institute for Food-Bioindustry, 111-18, Wonjangdong-gil, Deokjin-gu, Jeonju-si, Jeonbuk 54810,
Korea, E-mail: jhs@jif.re.kr
Author information: Young-Suk Kim (Professor)
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Insects are attracting worldwide attention as important future industrial resources. Insect farming attracts public attention for commercialization especially in Korea, partly because of government subsidies and also support based on the legislation of the so-called “insect industry law”. Insects have a high nutritional value and contain protein, amino acids, vitamin B, etc., and are suitable for animal feed following the natural food web. Currently, crickets and mealworms are the most widely utilized in this regard. In this study, we measured amino acid changes in fermented mealworms (Tenebrio molitor L.). In addition, control, positive, and fermented mealworm (FM) diets were provided to BALB/c mice for 8 weeks. There was no change in dietary and body weight during the 8 weeks. The number of lactic acid bacteria in the intestines significantly increased in the FM group. There was no change in the total number of microbiota in each group nor was there any change in the general bacteria, E. coli, and E. coli form. These results suggest that fermented mealworm can be considered as a dietary prebiotic to improve the microbiota diversity of the human intestinal environment. However, further study for human application is necessary.
Keywords: fermented mealworm, microbiota, microbiome, Firmicutes, Bacteroidetes
곤충에 대한 식용은 매우 오래전부터의 일이며(Jung, 2013), 더욱이 식용곤충 시장은 매년 성장하고 있어 국가에 따라서는 곤충산업을 전략산업으로 육성하고 있기도 하다. 전 세계적으로 식용곤충의 수는 현재 약 1,900여 종으로 알려져 있으며(Min 등, 2016), 그중 약 1,700여 종의 곤충들이 식품으로 섭취되고 있다(Siemianowska 등, 2013). 최근 연구에 의하면 곤충의 다양한 영양성분으로 인해 식량자원으로의 중요성이 부각되고 있으나 문화 및 식습관의 차이로 곤충을 식량자원으로 도입하는 데는 매우 부정적이다(Gmuer 등, 2016; Verbeke, 2015). 또한 선진국의 많은 소비자 역시 곤충을 “혐오음식”으로 인식하고 있고 소수의 사람만이 곤충을 섭취하고 있다. 수많은 식용곤충이 상업적 시장에서 소비자들에게 인정받지 못할 것으로 판단되나, 식용곤충의 영양적 가치를 무시하기에는 단백질, 지방, 미네랄 및 비타민 등의 영양소가 풍부하다(Kim 등, 2014). 특히, 식용곤충의 단백질 함량은 고기와 유사하게 약 15~22%가 포함되어 있다(Yi 등, 2013). 전 세계 인구의 증가가 단백질 공급원에 대한 수요를 증가시킴에 따라 경제적으로 유용한 가축 사양을 위한 토지의 이용은 매우 제한적이므로 동물성 단백질의 생산량이 부족할 것으로 예상된다. 따라서 식용곤충은 부족한 단백질 대체재로의 활용을 위해 대량의 사양법들이 개발되고 있고, 우리나라도 농업 경제 활성화의 일환으로 식용곤충 시장을 지원하고 있다.
갈색거저리 유충(밀웜,
갈색거저리 유충 발효물 제조
갈색거저리 유충의 발효물 제조를 위해 탈지된 갈색거저리 유충(MPC, MILAE Bioresources Co., Ltd., Seoul, Korea) 원료를 121°C에서 20분 동안 멸균했으며, 원료 110 kg을 실온에서 정제수 55 L와 함께 혼합하였다. 발효에 사용된 균주인
거저리 유충 발효물의 아미노산 분석
아미노산 분석을 위하여 갈색거저리 유충 및 발효물 분말 5 g과 6 N HCl 40 mL를 둥근 플라스크에 넣고 혼합한 다음 110°C에서 24시간 동안 질소가스를 주입하여 가수분해하였다. HCl을 50°C에서 감압 농축시킨 다음 농축시료는 0.2 N sodium citrate buffer(pH 2.2) 50 mL를 넣어 희석한 뒤 여과(0.45 μm)를 실시하였다. 여과한 시료(30 μL)는 아미노산 분석기(Model L-8900, Hitachi, Naka, Japan)를 이용하여 분석하였다.
실험동물의 사육
생후 5주령의 수컷 BALB/c 마우스(Samtako, Gyeonggi, Korea)를 구입한 다음 온도(22±2°C)와 상대습도(50±5°C) 그리고 명암이 12시간 단위로 조절되는 케이지에서 약 1주일간의 적응기간을 거쳤다. 실험군마다 마우스는 평균 체중이 약 18~20 g이 되도록 각 군당 10마리씩 3개 군으로 나누어 stainless steel bottomed cage에 5마리씩 분리 사육하였다.
식이 제조
실험의 정상대조군은 AIN-76A를 사용했으며, 사료대조군은 AIN-76A에서 단백질 및 탄수화물을 줄이고 말토덱스트린을 증가시켜 갈색거저리 유충 발효물과 조성을 동일하게 제조하여 식이로 사용하였다. 실험에 사용한 사료의 조성은 Table 1에 나타내었다.
Table 1 . Dietary composition
CTL (AIN-76A) | POSI | FM1) | ||||
---|---|---|---|---|---|---|
g | kcal | g | kcal | g | kcal | |
Casein | 1,000 | 4,000 | 750 | 3,000 | 750 | 3,000 |
Methionine | 15 | 60 | 15 | 60 | 15 | 60 |
Con starch | 750 | 3,000 | 500 | 2,000 | 500 | 2,000 |
Sucrose | 2,500 | 10,000 | 1,000 | 4,000 | 1,000 | 4,000 |
Cellulose | 250 | 0 | 250 | 0 | 250 | 0 |
Con oil | 250 | 2,250 | 250 | 2,250 | 250 | 2,250 |
Maltodextrin | 2,000 | 8,000 | ||||
FM 20% | 2,000 | 8,000 | ||||
Mineral | 175 | 0 | 175 | 0 | 175 | 0 |
Vitamin | 50 | 200 | 50 | 200 | 50 | 200 |
Choline bitratrate | 10 | 0 | 10 | 0 | 10 | 0 |
Total | 5,000 | 19,510 | 5,000 | 19,510 | 5,000 | 19,510 |
1)FM: fermented mealworm.
동물 모델
동물실험에서의 실험군의 분류는 정상대조군(Control, CTL), 사료대조군(Positive, POSI), 갈색거저리 유충 발효물(Fermented mealworm, FM) 3그룹으로 8주간 식이를 공급하였다. 8주 후 실험동물을 희생하여 혈액 및 소장과 맹장을 채취하였다. 모든 동물실험 및 관리는 (재)베리&바이오식품연구소 효능평가센터의 실험동물 윤리위원회 승인(동물실험 허가번호: BBRI-IACUC-18003) 하에 진행되었다.
장내 미생물 군집 분석
장내 총균, 대장균, 대장균군 및 유산균을 확인하기 위해 실험 최종일에 모든 실험동물의 소장을 양방향에서 결찰한 다음 적출하고 1×phosphate buffer saline으로 10배 희석하여 2분간 혼합하였다. 이후 10배 희석액을 연속적으로(10배) 희석한 뒤 1 mL를 취하여 총균(aerobic count plate, 3M, St. Paul, MN, USA), 대장균 및 대장균군(3M Petrifilm E. coli/coliform count plate, 3M), 유산균(3M Petrifilm lactic acid bacteria count plate, 3M) 분석용 페트리 필름에 도말한 다음 30~37°C에서 48시간 동안 배양하였다. 총균, 대장균, 대장균군, 유산균 수는 각각의 페트리 필름상의 전형적인 콜로니 수를 수동으로 계수하였다.
Next generation sequencing(NGS) 분석
장내 마이크로바이옴(microbiome) 분석을 위해 맹장(cecum) 내 존재하는 분변을 이용하여 맹장 내 박테리아의 총 DNA를 추출하였다(PowerSoil DNA Isolation kit, MO BIO Laboratories Inc., Hilden, Germany). 시료의 16S rRNA V3-V4 지역을 타깃으로 하는 프라이머(forward primer 5′ TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG/ reverse primer 5′ GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C)를 이용하여 증폭하였다. 증폭하여 정량이 끝난 시료는 MiSeq(Illumina, San Diego, CA, USA)을 이용하여 시퀀싱을 수행하였고, 시퀀싱 결과는 adapter trimming, merge paired-end reads, quality check, chimeric sequence 제거 과정을 통해 분석에 필요한 시퀀스를 획득하였다. 모든 결과는 RDP(v.2.11)를 이용하여 taxonomy profiling을 실시한 후 분석에 필요한 operational taxonomic units(OTUs, 97% identity)를 얻었다. 이후 QIIME를 이용하여 다양성 분석 및 LDA Effect Size(LEfSe)를 실시하여 그룹별 박테리아의 상대적 구성을 비교 분석하였다.
통계분석
모든 분석 자료는 평균±표준오차로 나타내었다. 실험결과는 SPSS(SPSS Inc., version 12.0, Chicago, IL, USA)를 이용하여 P<0.05 수준에서 통계처리 하였으며 Duncan’s multiple range test 또는 t-test를 통하여 검증하였다. 장내 미생물의 microbiome 분석은 LEfSe의 Kruskal-Wallis와 Wilcoxon tests, Manna-Whitney test를 이용하여 P< 0.05에서 통계처리 하였다.
갈색거저리 발효에 따른 아미노산 변화
갈색거저리 유충의 발효과정을 거친 뒤 아미노산의 변화를 확인하였다(Table 2). 분석된 18종의 아미노산 성분이 대부분 모두 증가하였고 발효과정을 거치면서 최소 2배에서 최대 13배까지 증가하였다. 특히 필수아미노산인 발린은 1,361.1±0.81 μg/g에서 4,446.0±0.36 μg/g으로 3.2배, 메티오닌은 79.5±1.96 μg/g에서 392.4±1.18 μg/g으로 4.9배, 페닐알라닌은 258.5±0.84 μg/g에서 2,249.5±0.85 μg/g으로 8.7배 증가하였다. 본 연구에서 확인된 결과와 마찬가지로 발효과정을 거친 갈색거저리의 아미노산 증가는 Borremans 등(2020a, 2020b)의 연구결과와 동일한 결과를 확인할 수 있었고, 갈색거저리를 데친 후 발효과정을 거치면서 아미노산과 저분자 수용성 단백질의 양이 증가하였다고 보고하였다. 본 연구에서 갈색거저리 유충이 발효과정을 통해 대부분의 아미노산 함량이 증가한 사실을 바탕으로 단백질의 구조와 양적 변화를 통해 기능적 변화에 영향을 미칠 것으로 사료된다.
Table 2 . The changes of amino acid content in fermented meal-worm
Amino acid (μg/g) | M1) | FM2) |
---|---|---|
Glycine | 290.0±1.53 | 3,390.0±1.23* |
Alanine | 1,284.6±0.56 | 6,698.7±2.56* |
Serine | 346.5±1.20 | 4,476.5±1.51* |
Proline | 4,293.3±0.31* | 2,717.8±0.65 |
Valine | 1,361.1±0.81 | 4,446.0±0.36* |
Threonine | 166.6±0.45 | 2,622.0±0.54* |
Leucine | 388.6±1.03 | 5,117.7±0.91* |
isoleucine | 611.3±0.56 | 3,096.0±0.56* |
Asparagine | 92.4±0.58 | 198.0±1.26* |
Aspartic acid | 106.4±0.98 | 3,626.5±1.59* |
Lysine | 515.9±0.65 | 2,209.5±1.96* |
Glutamine | 1,109.6±0.49* | 233.6±1.05 |
Glutamic acid | 1,945.3±1.03 | 9,594.2±1.14* |
Methionine | 79.5±1.96 | 392.4±1.18* |
Histidine | 723.3±0.54* | 676.8±0.98 |
Phenyl alanine | 258.5±0.84 | 2,249.5±0.85* |
Arginine | 2,479.5±0.55* | 1,983.6±0.77 |
Tyrosine | 1,442.0±0.14 | 3,782.9±0.64* |
1)M: mealworm.
2)FM: fermented mealworm.
*Significantly different between M and FM according to t-test at
소장 내 갈색거저리 유충 발효물의 prebiotic 효과
갈색거저리 유충 발효물의 microbiota 분석을 위해 갈색거저리 유충 발효물이 첨가된 사료를 제작하여(Table 1) 8주 동안 마우스에게 제공하였다. 각각의 사료를 섭취시킨 그룹 간 실험동물의 사료 섭취량과 체중에는 변화가 없었다(data not shown). 실험동물 희생 후 소장을 적출한 다음 총균, 대장균, 대장균군, 유산균 수를 확인하였다(Table 3).
Table 3 . Total bacteria,
TBC1) | LAB2) | |||
---|---|---|---|---|
CTL | 3.4±1.2 | 4.5±1.3a | 2.1±1.6 | 2.1±1.6 |
POSI | 2.2±0.9 | 3.0±1.0b | 0.4±0.5 | 0.4±0.5 |
FM3) | 3.1±0.5 | 4.4±0.5a | 1.3±0.4 | 1.2±0.6 |
1)TBC: total bacteria.
2)LAB: lactic acid bacteria.
3)FM: fermented mealworm.
Values followed by different letters (a,b) are significantly different (
총균수는 CTL 그룹에서 3.4±1.2 log CFU/mL, POSI 그룹에서 2.2±0.9 log CFU/mL 그리고 FM 그룹에서 3.1±0.5 log CFU/mL로 측정되었고, CTL, POSI, FM 그룹 간에 유의적인 차이가 없었다. 대장균 수의 경우 CTL 그룹은 2.1 ±1.6 log CFU/mL, POSI 그룹은 0.4±0.5 log CFU/mL, FM 그룹은 1.3±0.4 log CFU/mL로 대장균의 경우도 각 그룹 간에 차이가 없는 것을 확인하였다. 또한 대장균군의 경우도 마찬가지로 CTL, POSI, FM 그룹은 각각 2.1±1.6 log CFU/mL, 0.4±0.5 log CFU/mL, 1.2±0.6 log CFU/mL로 각 그룹 간에 통계학적 유의성은 없었다. 유산균의 경우 CTL 그룹에서 4.5±1.3 log CFU/mL, POSI 그룹에서 3.0±1 log CFU/mL 그리고 FM 그룹에서 4.4±0.5 log CFU/mL로 측정되었고, 이는 CTL 그룹과 비교했을 때 FM을 섭취시킨 그룹과 차이는 없었으나 POSI 그룹과 비교했을 때 FM의 공급은 소장 내 유산균 수를 증가시키는 것으로 확인되었다. 본 연구에서 일반 식이를 섭취시킨 마우스의 장내 미생물과 비교했을 때 갈색거저리 유충 발효물을 섭취시킨 마우스의 장내 미생물은 드라마틱한 변화를 나타내지 않았으나, 유산균 수에 영향을 미치지 않으면서 대장균과 대장균군의 수가 다소 감소하는 경향을 나타내는 것으로 미루어볼 때 갈색거저리 유충 발효물의 섭취가 유해균 감소를 통해 장내 환경개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
갈색거저리 유충에는 키틴 및 키토산이 다량 존재한다고 알려져 있으며(Song 등, 2018), Hamed 등(2016)의 키틴 및 키토산이 BALB/c 마우스에서 유산균의 성장을 촉진한다는 연구 내용을 고려해볼 때 갈색거저리 유충 발효물의 키틴 및 키토산의 섭취에 따른 장내 미생물에 대한 추가 연구가 진행돼야 할 것으로 여겨진다.
NGS를 통한 microbiome 분석
갈색거저리 유충 발효물이 microbiome에 미치는 영향을 확인하기 위해 NGS 분석을 시행하였고 결과는 relative abundance(%)로 나타내었다(Fig. 1). CTL 그룹은 2,206.10 ±272.24, POSI 그룹은 1,812.70±87.39, FM 그룹은 2,897.90±189.83개의 박테리아를 획득하였다(Fig. 1A). Taxonomy 분석을 통해 얻은 OTU를 바탕으로 다양성 분석을 실시한 결과 alpha diversity(Fig. 1B)를 통해 FM 그룹에서 미생물 종의 다양성이 증가함을 확인하였고, beta diversity(Fig. 1C)를 통해 family 단계와 genus 단계에서 그 다양성 구성에 차이가 있음을 확인하였다. 다양성 구성에 대한 heat map 분석결과(Fig. 2), phylum 단계의 3그룹 모두에서
장내 미생물 불균형은 자가면역질환, 알레르기, 비만, 당뇨병, 감염질환 등과 밀접한 관련이 있다고 보고된 바 있다(Kamada 등, 2013). 정상인과 비교했을 때 과민성대장증후군 환자의 microbiota는
본 연구에서
본 연구에서는 갈색거저리 유충의 발효과정을 통해 아미노산의 함량 변화를 확인하고, 발효물을 사료로 제작하여 마우스에게 8주간 섭취시켰을 때 마우스 소장 내 미생물 군집 수 변화와 microbiota 분석을 진행하였다. 갈색거저리 유충은 발효과정을 거치면서 대부분의 아미노산 함량이 증가하였다. 또한 갈색거저리 유충 발효물을 마우스에게 섭취시킨 결과 마우스 장내에 존재하는 총균 및 유산균 변화에는 영향을 미치지 않으나, 대장균 및 대장균군의 유해군을 감소시키는 영향을 나타내었다. 또한 갈색거저리 유충 발효물의 섭취가 microbiome의 다양성을 증가시키며
곤충은 세계의 중요한 미래 산업 자원으로 주목받고 있다. 특히 한국에서 곤충은 “곤충산업법”으로 불리는 정부 지원정책으로 대중의 관심을 모으고 있다. 곤충은 천연식품으로 단백질, 아미노산, 비타민 B 등의 영양적 가치가 높고 동물 사료에도 적합하다. 현재 귀뚜라미와 갈색거저리 유충(밀웜)이 널리 이용되고 있다. 본 연구에서는 갈색거저리 유충을 이용하여 발효과정을 거친 후 아미노산의 변화를 확인하였다. 또한 발효물을 이용한 사료를 제작하여 8주 동안 BALB/c 마우스에게 제공한 뒤 장내 미생물 분석을 시행하였다. 사료를 8주 동안 제공했을 때 체중의 변화는 없었다. 각 그룹의 장내 미생물 전체 수는 변하지 않았다. 일반세균, 대장균 및 대장균군 모두 그룹 간 어떠한 변화도 보이지 않았으나, FM 그룹에서 장내 유산균의 비율이 현저히 증가하였고 장내 미생물의 다양성을 증가시키는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 갈색거저리 유충 발효물이 인간의 장내 환경개선을 위한 prebiotics로서 가능성을 시사하지만, 인간에 대한 추가 적용 연구가 필요할 것으로 판단된다.
본 연구는 농림축산식품부의 재원으로 농림수산식품기술기획평가원의 기술사업화지원사업의 지원을 받아 이루어졌으며 이에 감사드립니다(817025-03-2-HD030).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2021; 50(6): 543-550
Published online June 30, 2021 https://doi.org/10.3746/jkfn.2021.50.6.543
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
이수정1․권규택1․정이형2․유종상3․조경훈3․김용석4․장한수2
1(재)베리&바이오식품연구소, 2전북바이오융합산업진흥원 3(주)대한사료, 4전북대학교 식품공학과
Su Jung Lee1 , Gyoo Taik Kwon1, Yi Hyung Chung2, Jong-Sang Yoo3, Kyung-Hoon Cho3, Young-Suk Kim4, and Han Su Jang2
1Berry & Biofood Research Institute, 2Jeonbuk Institute for Food-Bioindustry, 3Daehan Feed Co., Ltd. 4Department of Food Science and Technology, Chonbuk National University
Correspondence to:Han Su Jang, Jeonbuk Institute for Food-Bioindustry, 111-18, Wonjangdong-gil, Deokjin-gu, Jeonju-si, Jeonbuk 54810,
Korea, E-mail: jhs@jif.re.kr
Author information: Young-Suk Kim (Professor)
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Insects are attracting worldwide attention as important future industrial resources. Insect farming attracts public attention for commercialization especially in Korea, partly because of government subsidies and also support based on the legislation of the so-called “insect industry law”. Insects have a high nutritional value and contain protein, amino acids, vitamin B, etc., and are suitable for animal feed following the natural food web. Currently, crickets and mealworms are the most widely utilized in this regard. In this study, we measured amino acid changes in fermented mealworms (Tenebrio molitor L.). In addition, control, positive, and fermented mealworm (FM) diets were provided to BALB/c mice for 8 weeks. There was no change in dietary and body weight during the 8 weeks. The number of lactic acid bacteria in the intestines significantly increased in the FM group. There was no change in the total number of microbiota in each group nor was there any change in the general bacteria, E. coli, and E. coli form. These results suggest that fermented mealworm can be considered as a dietary prebiotic to improve the microbiota diversity of the human intestinal environment. However, further study for human application is necessary.
Keywords: fermented mealworm, microbiota, microbiome, Firmicutes, Bacteroidetes
곤충에 대한 식용은 매우 오래전부터의 일이며(Jung, 2013), 더욱이 식용곤충 시장은 매년 성장하고 있어 국가에 따라서는 곤충산업을 전략산업으로 육성하고 있기도 하다. 전 세계적으로 식용곤충의 수는 현재 약 1,900여 종으로 알려져 있으며(Min 등, 2016), 그중 약 1,700여 종의 곤충들이 식품으로 섭취되고 있다(Siemianowska 등, 2013). 최근 연구에 의하면 곤충의 다양한 영양성분으로 인해 식량자원으로의 중요성이 부각되고 있으나 문화 및 식습관의 차이로 곤충을 식량자원으로 도입하는 데는 매우 부정적이다(Gmuer 등, 2016; Verbeke, 2015). 또한 선진국의 많은 소비자 역시 곤충을 “혐오음식”으로 인식하고 있고 소수의 사람만이 곤충을 섭취하고 있다. 수많은 식용곤충이 상업적 시장에서 소비자들에게 인정받지 못할 것으로 판단되나, 식용곤충의 영양적 가치를 무시하기에는 단백질, 지방, 미네랄 및 비타민 등의 영양소가 풍부하다(Kim 등, 2014). 특히, 식용곤충의 단백질 함량은 고기와 유사하게 약 15~22%가 포함되어 있다(Yi 등, 2013). 전 세계 인구의 증가가 단백질 공급원에 대한 수요를 증가시킴에 따라 경제적으로 유용한 가축 사양을 위한 토지의 이용은 매우 제한적이므로 동물성 단백질의 생산량이 부족할 것으로 예상된다. 따라서 식용곤충은 부족한 단백질 대체재로의 활용을 위해 대량의 사양법들이 개발되고 있고, 우리나라도 농업 경제 활성화의 일환으로 식용곤충 시장을 지원하고 있다.
갈색거저리 유충(밀웜,
갈색거저리 유충 발효물 제조
갈색거저리 유충의 발효물 제조를 위해 탈지된 갈색거저리 유충(MPC, MILAE Bioresources Co., Ltd., Seoul, Korea) 원료를 121°C에서 20분 동안 멸균했으며, 원료 110 kg을 실온에서 정제수 55 L와 함께 혼합하였다. 발효에 사용된 균주인
거저리 유충 발효물의 아미노산 분석
아미노산 분석을 위하여 갈색거저리 유충 및 발효물 분말 5 g과 6 N HCl 40 mL를 둥근 플라스크에 넣고 혼합한 다음 110°C에서 24시간 동안 질소가스를 주입하여 가수분해하였다. HCl을 50°C에서 감압 농축시킨 다음 농축시료는 0.2 N sodium citrate buffer(pH 2.2) 50 mL를 넣어 희석한 뒤 여과(0.45 μm)를 실시하였다. 여과한 시료(30 μL)는 아미노산 분석기(Model L-8900, Hitachi, Naka, Japan)를 이용하여 분석하였다.
실험동물의 사육
생후 5주령의 수컷 BALB/c 마우스(Samtako, Gyeonggi, Korea)를 구입한 다음 온도(22±2°C)와 상대습도(50±5°C) 그리고 명암이 12시간 단위로 조절되는 케이지에서 약 1주일간의 적응기간을 거쳤다. 실험군마다 마우스는 평균 체중이 약 18~20 g이 되도록 각 군당 10마리씩 3개 군으로 나누어 stainless steel bottomed cage에 5마리씩 분리 사육하였다.
식이 제조
실험의 정상대조군은 AIN-76A를 사용했으며, 사료대조군은 AIN-76A에서 단백질 및 탄수화물을 줄이고 말토덱스트린을 증가시켜 갈색거저리 유충 발효물과 조성을 동일하게 제조하여 식이로 사용하였다. 실험에 사용한 사료의 조성은 Table 1에 나타내었다.
Table 1 . Dietary composition.
CTL (AIN-76A) | POSI | FM1) | ||||
---|---|---|---|---|---|---|
g | kcal | g | kcal | g | kcal | |
Casein | 1,000 | 4,000 | 750 | 3,000 | 750 | 3,000 |
Methionine | 15 | 60 | 15 | 60 | 15 | 60 |
Con starch | 750 | 3,000 | 500 | 2,000 | 500 | 2,000 |
Sucrose | 2,500 | 10,000 | 1,000 | 4,000 | 1,000 | 4,000 |
Cellulose | 250 | 0 | 250 | 0 | 250 | 0 |
Con oil | 250 | 2,250 | 250 | 2,250 | 250 | 2,250 |
Maltodextrin | 2,000 | 8,000 | ||||
FM 20% | 2,000 | 8,000 | ||||
Mineral | 175 | 0 | 175 | 0 | 175 | 0 |
Vitamin | 50 | 200 | 50 | 200 | 50 | 200 |
Choline bitratrate | 10 | 0 | 10 | 0 | 10 | 0 |
Total | 5,000 | 19,510 | 5,000 | 19,510 | 5,000 | 19,510 |
1)FM: fermented mealworm..
동물 모델
동물실험에서의 실험군의 분류는 정상대조군(Control, CTL), 사료대조군(Positive, POSI), 갈색거저리 유충 발효물(Fermented mealworm, FM) 3그룹으로 8주간 식이를 공급하였다. 8주 후 실험동물을 희생하여 혈액 및 소장과 맹장을 채취하였다. 모든 동물실험 및 관리는 (재)베리&바이오식품연구소 효능평가센터의 실험동물 윤리위원회 승인(동물실험 허가번호: BBRI-IACUC-18003) 하에 진행되었다.
장내 미생물 군집 분석
장내 총균, 대장균, 대장균군 및 유산균을 확인하기 위해 실험 최종일에 모든 실험동물의 소장을 양방향에서 결찰한 다음 적출하고 1×phosphate buffer saline으로 10배 희석하여 2분간 혼합하였다. 이후 10배 희석액을 연속적으로(10배) 희석한 뒤 1 mL를 취하여 총균(aerobic count plate, 3M, St. Paul, MN, USA), 대장균 및 대장균군(3M Petrifilm E. coli/coliform count plate, 3M), 유산균(3M Petrifilm lactic acid bacteria count plate, 3M) 분석용 페트리 필름에 도말한 다음 30~37°C에서 48시간 동안 배양하였다. 총균, 대장균, 대장균군, 유산균 수는 각각의 페트리 필름상의 전형적인 콜로니 수를 수동으로 계수하였다.
Next generation sequencing(NGS) 분석
장내 마이크로바이옴(microbiome) 분석을 위해 맹장(cecum) 내 존재하는 분변을 이용하여 맹장 내 박테리아의 총 DNA를 추출하였다(PowerSoil DNA Isolation kit, MO BIO Laboratories Inc., Hilden, Germany). 시료의 16S rRNA V3-V4 지역을 타깃으로 하는 프라이머(forward primer 5′ TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG/ reverse primer 5′ GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C)를 이용하여 증폭하였다. 증폭하여 정량이 끝난 시료는 MiSeq(Illumina, San Diego, CA, USA)을 이용하여 시퀀싱을 수행하였고, 시퀀싱 결과는 adapter trimming, merge paired-end reads, quality check, chimeric sequence 제거 과정을 통해 분석에 필요한 시퀀스를 획득하였다. 모든 결과는 RDP(v.2.11)를 이용하여 taxonomy profiling을 실시한 후 분석에 필요한 operational taxonomic units(OTUs, 97% identity)를 얻었다. 이후 QIIME를 이용하여 다양성 분석 및 LDA Effect Size(LEfSe)를 실시하여 그룹별 박테리아의 상대적 구성을 비교 분석하였다.
통계분석
모든 분석 자료는 평균±표준오차로 나타내었다. 실험결과는 SPSS(SPSS Inc., version 12.0, Chicago, IL, USA)를 이용하여 P<0.05 수준에서 통계처리 하였으며 Duncan’s multiple range test 또는 t-test를 통하여 검증하였다. 장내 미생물의 microbiome 분석은 LEfSe의 Kruskal-Wallis와 Wilcoxon tests, Manna-Whitney test를 이용하여 P< 0.05에서 통계처리 하였다.
갈색거저리 발효에 따른 아미노산 변화
갈색거저리 유충의 발효과정을 거친 뒤 아미노산의 변화를 확인하였다(Table 2). 분석된 18종의 아미노산 성분이 대부분 모두 증가하였고 발효과정을 거치면서 최소 2배에서 최대 13배까지 증가하였다. 특히 필수아미노산인 발린은 1,361.1±0.81 μg/g에서 4,446.0±0.36 μg/g으로 3.2배, 메티오닌은 79.5±1.96 μg/g에서 392.4±1.18 μg/g으로 4.9배, 페닐알라닌은 258.5±0.84 μg/g에서 2,249.5±0.85 μg/g으로 8.7배 증가하였다. 본 연구에서 확인된 결과와 마찬가지로 발효과정을 거친 갈색거저리의 아미노산 증가는 Borremans 등(2020a, 2020b)의 연구결과와 동일한 결과를 확인할 수 있었고, 갈색거저리를 데친 후 발효과정을 거치면서 아미노산과 저분자 수용성 단백질의 양이 증가하였다고 보고하였다. 본 연구에서 갈색거저리 유충이 발효과정을 통해 대부분의 아미노산 함량이 증가한 사실을 바탕으로 단백질의 구조와 양적 변화를 통해 기능적 변화에 영향을 미칠 것으로 사료된다.
Table 2 . The changes of amino acid content in fermented meal-worm.
Amino acid (μg/g) | M1) | FM2) |
---|---|---|
Glycine | 290.0±1.53 | 3,390.0±1.23* |
Alanine | 1,284.6±0.56 | 6,698.7±2.56* |
Serine | 346.5±1.20 | 4,476.5±1.51* |
Proline | 4,293.3±0.31* | 2,717.8±0.65 |
Valine | 1,361.1±0.81 | 4,446.0±0.36* |
Threonine | 166.6±0.45 | 2,622.0±0.54* |
Leucine | 388.6±1.03 | 5,117.7±0.91* |
isoleucine | 611.3±0.56 | 3,096.0±0.56* |
Asparagine | 92.4±0.58 | 198.0±1.26* |
Aspartic acid | 106.4±0.98 | 3,626.5±1.59* |
Lysine | 515.9±0.65 | 2,209.5±1.96* |
Glutamine | 1,109.6±0.49* | 233.6±1.05 |
Glutamic acid | 1,945.3±1.03 | 9,594.2±1.14* |
Methionine | 79.5±1.96 | 392.4±1.18* |
Histidine | 723.3±0.54* | 676.8±0.98 |
Phenyl alanine | 258.5±0.84 | 2,249.5±0.85* |
Arginine | 2,479.5±0.55* | 1,983.6±0.77 |
Tyrosine | 1,442.0±0.14 | 3,782.9±0.64* |
1)M: mealworm..
2)FM: fermented mealworm..
*Significantly different between M and FM according to t-test at
소장 내 갈색거저리 유충 발효물의 prebiotic 효과
갈색거저리 유충 발효물의 microbiota 분석을 위해 갈색거저리 유충 발효물이 첨가된 사료를 제작하여(Table 1) 8주 동안 마우스에게 제공하였다. 각각의 사료를 섭취시킨 그룹 간 실험동물의 사료 섭취량과 체중에는 변화가 없었다(data not shown). 실험동물 희생 후 소장을 적출한 다음 총균, 대장균, 대장균군, 유산균 수를 확인하였다(Table 3).
Table 3 . Total bacteria,
TBC1) | LAB2) | |||
---|---|---|---|---|
CTL | 3.4±1.2 | 4.5±1.3a | 2.1±1.6 | 2.1±1.6 |
POSI | 2.2±0.9 | 3.0±1.0b | 0.4±0.5 | 0.4±0.5 |
FM3) | 3.1±0.5 | 4.4±0.5a | 1.3±0.4 | 1.2±0.6 |
1)TBC: total bacteria..
2)LAB: lactic acid bacteria..
3)FM: fermented mealworm..
Values followed by different letters (a,b) are significantly different (
총균수는 CTL 그룹에서 3.4±1.2 log CFU/mL, POSI 그룹에서 2.2±0.9 log CFU/mL 그리고 FM 그룹에서 3.1±0.5 log CFU/mL로 측정되었고, CTL, POSI, FM 그룹 간에 유의적인 차이가 없었다. 대장균 수의 경우 CTL 그룹은 2.1 ±1.6 log CFU/mL, POSI 그룹은 0.4±0.5 log CFU/mL, FM 그룹은 1.3±0.4 log CFU/mL로 대장균의 경우도 각 그룹 간에 차이가 없는 것을 확인하였다. 또한 대장균군의 경우도 마찬가지로 CTL, POSI, FM 그룹은 각각 2.1±1.6 log CFU/mL, 0.4±0.5 log CFU/mL, 1.2±0.6 log CFU/mL로 각 그룹 간에 통계학적 유의성은 없었다. 유산균의 경우 CTL 그룹에서 4.5±1.3 log CFU/mL, POSI 그룹에서 3.0±1 log CFU/mL 그리고 FM 그룹에서 4.4±0.5 log CFU/mL로 측정되었고, 이는 CTL 그룹과 비교했을 때 FM을 섭취시킨 그룹과 차이는 없었으나 POSI 그룹과 비교했을 때 FM의 공급은 소장 내 유산균 수를 증가시키는 것으로 확인되었다. 본 연구에서 일반 식이를 섭취시킨 마우스의 장내 미생물과 비교했을 때 갈색거저리 유충 발효물을 섭취시킨 마우스의 장내 미생물은 드라마틱한 변화를 나타내지 않았으나, 유산균 수에 영향을 미치지 않으면서 대장균과 대장균군의 수가 다소 감소하는 경향을 나타내는 것으로 미루어볼 때 갈색거저리 유충 발효물의 섭취가 유해균 감소를 통해 장내 환경개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
갈색거저리 유충에는 키틴 및 키토산이 다량 존재한다고 알려져 있으며(Song 등, 2018), Hamed 등(2016)의 키틴 및 키토산이 BALB/c 마우스에서 유산균의 성장을 촉진한다는 연구 내용을 고려해볼 때 갈색거저리 유충 발효물의 키틴 및 키토산의 섭취에 따른 장내 미생물에 대한 추가 연구가 진행돼야 할 것으로 여겨진다.
NGS를 통한 microbiome 분석
갈색거저리 유충 발효물이 microbiome에 미치는 영향을 확인하기 위해 NGS 분석을 시행하였고 결과는 relative abundance(%)로 나타내었다(Fig. 1). CTL 그룹은 2,206.10 ±272.24, POSI 그룹은 1,812.70±87.39, FM 그룹은 2,897.90±189.83개의 박테리아를 획득하였다(Fig. 1A). Taxonomy 분석을 통해 얻은 OTU를 바탕으로 다양성 분석을 실시한 결과 alpha diversity(Fig. 1B)를 통해 FM 그룹에서 미생물 종의 다양성이 증가함을 확인하였고, beta diversity(Fig. 1C)를 통해 family 단계와 genus 단계에서 그 다양성 구성에 차이가 있음을 확인하였다. 다양성 구성에 대한 heat map 분석결과(Fig. 2), phylum 단계의 3그룹 모두에서
장내 미생물 불균형은 자가면역질환, 알레르기, 비만, 당뇨병, 감염질환 등과 밀접한 관련이 있다고 보고된 바 있다(Kamada 등, 2013). 정상인과 비교했을 때 과민성대장증후군 환자의 microbiota는
본 연구에서
본 연구에서는 갈색거저리 유충의 발효과정을 통해 아미노산의 함량 변화를 확인하고, 발효물을 사료로 제작하여 마우스에게 8주간 섭취시켰을 때 마우스 소장 내 미생물 군집 수 변화와 microbiota 분석을 진행하였다. 갈색거저리 유충은 발효과정을 거치면서 대부분의 아미노산 함량이 증가하였다. 또한 갈색거저리 유충 발효물을 마우스에게 섭취시킨 결과 마우스 장내에 존재하는 총균 및 유산균 변화에는 영향을 미치지 않으나, 대장균 및 대장균군의 유해군을 감소시키는 영향을 나타내었다. 또한 갈색거저리 유충 발효물의 섭취가 microbiome의 다양성을 증가시키며
곤충은 세계의 중요한 미래 산업 자원으로 주목받고 있다. 특히 한국에서 곤충은 “곤충산업법”으로 불리는 정부 지원정책으로 대중의 관심을 모으고 있다. 곤충은 천연식품으로 단백질, 아미노산, 비타민 B 등의 영양적 가치가 높고 동물 사료에도 적합하다. 현재 귀뚜라미와 갈색거저리 유충(밀웜)이 널리 이용되고 있다. 본 연구에서는 갈색거저리 유충을 이용하여 발효과정을 거친 후 아미노산의 변화를 확인하였다. 또한 발효물을 이용한 사료를 제작하여 8주 동안 BALB/c 마우스에게 제공한 뒤 장내 미생물 분석을 시행하였다. 사료를 8주 동안 제공했을 때 체중의 변화는 없었다. 각 그룹의 장내 미생물 전체 수는 변하지 않았다. 일반세균, 대장균 및 대장균군 모두 그룹 간 어떠한 변화도 보이지 않았으나, FM 그룹에서 장내 유산균의 비율이 현저히 증가하였고 장내 미생물의 다양성을 증가시키는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 갈색거저리 유충 발효물이 인간의 장내 환경개선을 위한 prebiotics로서 가능성을 시사하지만, 인간에 대한 추가 적용 연구가 필요할 것으로 판단된다.
본 연구는 농림축산식품부의 재원으로 농림수산식품기술기획평가원의 기술사업화지원사업의 지원을 받아 이루어졌으며 이에 감사드립니다(817025-03-2-HD030).
Table 1 . Dietary composition.
CTL (AIN-76A) | POSI | FM1) | ||||
---|---|---|---|---|---|---|
g | kcal | g | kcal | g | kcal | |
Casein | 1,000 | 4,000 | 750 | 3,000 | 750 | 3,000 |
Methionine | 15 | 60 | 15 | 60 | 15 | 60 |
Con starch | 750 | 3,000 | 500 | 2,000 | 500 | 2,000 |
Sucrose | 2,500 | 10,000 | 1,000 | 4,000 | 1,000 | 4,000 |
Cellulose | 250 | 0 | 250 | 0 | 250 | 0 |
Con oil | 250 | 2,250 | 250 | 2,250 | 250 | 2,250 |
Maltodextrin | 2,000 | 8,000 | ||||
FM 20% | 2,000 | 8,000 | ||||
Mineral | 175 | 0 | 175 | 0 | 175 | 0 |
Vitamin | 50 | 200 | 50 | 200 | 50 | 200 |
Choline bitratrate | 10 | 0 | 10 | 0 | 10 | 0 |
Total | 5,000 | 19,510 | 5,000 | 19,510 | 5,000 | 19,510 |
1)FM: fermented mealworm..
Table 2 . The changes of amino acid content in fermented meal-worm.
Amino acid (μg/g) | M1) | FM2) |
---|---|---|
Glycine | 290.0±1.53 | 3,390.0±1.23* |
Alanine | 1,284.6±0.56 | 6,698.7±2.56* |
Serine | 346.5±1.20 | 4,476.5±1.51* |
Proline | 4,293.3±0.31* | 2,717.8±0.65 |
Valine | 1,361.1±0.81 | 4,446.0±0.36* |
Threonine | 166.6±0.45 | 2,622.0±0.54* |
Leucine | 388.6±1.03 | 5,117.7±0.91* |
isoleucine | 611.3±0.56 | 3,096.0±0.56* |
Asparagine | 92.4±0.58 | 198.0±1.26* |
Aspartic acid | 106.4±0.98 | 3,626.5±1.59* |
Lysine | 515.9±0.65 | 2,209.5±1.96* |
Glutamine | 1,109.6±0.49* | 233.6±1.05 |
Glutamic acid | 1,945.3±1.03 | 9,594.2±1.14* |
Methionine | 79.5±1.96 | 392.4±1.18* |
Histidine | 723.3±0.54* | 676.8±0.98 |
Phenyl alanine | 258.5±0.84 | 2,249.5±0.85* |
Arginine | 2,479.5±0.55* | 1,983.6±0.77 |
Tyrosine | 1,442.0±0.14 | 3,782.9±0.64* |
1)M: mealworm..
2)FM: fermented mealworm..
*Significantly different between M and FM according to t-test at
Table 3 . Total bacteria,
TBC1) | LAB2) | |||
---|---|---|---|---|
CTL | 3.4±1.2 | 4.5±1.3a | 2.1±1.6 | 2.1±1.6 |
POSI | 2.2±0.9 | 3.0±1.0b | 0.4±0.5 | 0.4±0.5 |
FM3) | 3.1±0.5 | 4.4±0.5a | 1.3±0.4 | 1.2±0.6 |
1)TBC: total bacteria..
2)LAB: lactic acid bacteria..
3)FM: fermented mealworm..
Values followed by different letters (a,b) are significantly different (
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